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在臨床前和臨床研究中，LBA是用于定量分析抗體生物藥、抗藥物抗體和可溶性蛋白生物標志物濃度的重要方法之一。但由于研究樣本主要由復雜的生物基質組成，這些基質可能表現出一定的干擾性，從而導致不準確的定量結果。本文將著重討論在藥物開發過程中如何緩解或消除對LBA定量分析方法干擾的策略，重點關注抗體生物藥的定量分析。

由于篇幅有限，本文將采用上下篇的形式來展開論述，敬請垂注！

抗體生物藥在批準上市的生物藥中占有很大的比例。

自1986年首次批準鼠抗體Muronomab-CD3上市，到2013年通過Glyco工程人源化的obinutuzumab上市以來，共36個抗體藥物獲批用于治療人類疾病。開發抗體藥物的一個重要部分是分析藥物的藥（毒）代動力學/（PK/TK），藥效動力學（PD）和免疫原性（immunogenicity）表征。

動物研究中的PK和PD數據可用于PK/PD建模，并指導人體首次劑量的選擇，隨后可以啟動PK/PD迭代建模和仿真（simulation）的過程，從而完善從早期到晚期的臨床開發過程中的劑量選擇。可靠的PK和PD數據是成功地進行 PK/PD 建模和仿真的先決條件，生物藥的免疫原性也能對其PK產生很大的影響，是臨床安全評估的重要組成部分。

此外，在臨床研究中準確評估適當的生物標志物可以為靶標參與度、藥理機制證明和原理證明以及選擇最有可能對藥物作出響應的患者群體提供有價值的信息。

免疫測試方法（Immunoassays）或更廣義地稱為配體結合式測試方法（ligand binding assays, LBA）是一種常用的分析方法，用于測定抗體藥物、抗藥物抗體（ADA）和可溶性蛋白生物標志物（soluble protein biomarkers）。這些測試針對的生物樣本是復雜的基質，包含各種成分，其可以顯著地影響定量待測物的準確性。對分析方法的干擾（interference）之前在文獻中討論過，但關注的重點是臨床化驗室中所使用的化驗方法，藥物開發過程中使用的許多檢測方法是定制開發的，對其表征也較少。

本文將側重于用于評估定量分析抗體生物藥濃度和ADA時遇到的干擾以及緩解干擾的策略。

關鍵術語

干擾：測定值與實際值不同的現象。干擾可能來自物質（substances）、測試程序、試劑和樣本的采集/處理。

相關文獻中之前提出干擾的定義是：樣品中存在的物質，其發揮影響或效應改變了對一個待測物的正確的分析結果；該結果通常表達為待測物的濃度或活性數值。干擾可以區分為依賴于待測物的和不依賴于待測物的兩類。依賴于待測物的干擾包括直接影響對待測物的檢測（detection of the analyte）的所有因素。不依賴于待測物的干擾能夠在沒有待測物的情況下產生檢測信號，或直接抑制測試試劑。干擾導致結果的不真實可以是增加的或者減少的。

基質干擾：導致測定的待測物濃度與其真實濃度不同的任何基質成分，引起基質干擾的物質分子通常不得而知。

基質干擾通常稱為非特異性。一個測試方法是被設計用于檢測（detect）某個特定的待測物，基質中任何能夠產生檢測信號或者抑制待測物信號的組成成分都可以定義為非特異性干擾。

然而，在對測試方法和待測物的生物學進行詳細評估之后，通常所觀察到的干擾并不令人驚訝，并且是由一個確定的生物分子引起的。因此，生物分析必須嚴格地審視現有的文獻以及之前的研究成果和試劑的特異性，以便相應地確定該測試方法的特異性（specificity）。通常，干擾（Interference）和特異性是相關的， 一個擁有絕對特異性的測試方法不應受到任何基質干擾的影響。

但是，生物基質較為復雜。即便對測試方法的系統和待測物的生物學有深度理解，也并不總是足以防止干擾的發生。與很少只檢測到單一條帶的western blots方法相似，大多數免疫測試方法（immunoassays）的特異性并不總是只針對一個待測物（圖1舉例說明了不同類型的干擾）。此外，干擾物質的分子性質是未知的，減少干擾最常用的方法是樣本稀釋。這種方法被廣泛地使用，以致于大多數分析科學家傾向于稀釋所有的樣本，而不相信未稀釋樣本的檢測結果。

一類值得特別注意的干擾物質是樣本中的抗體。Heterophilic抗體一般具有廣泛的反應性、低親和力、能交聯（crosslink）捕獲和檢測抗體，容易導致錯誤的高信號結果。人抗動物抗體被認為具有較高的親和力，由于許多測試試劑含有來自小鼠的單克隆抗體，因此，人抗小鼠抗體是特別相關的一類干擾物質。

當今臨床上使用的測試方法仍然在某種程度上對heterophilic敏感，臨床醫生應該考慮相關策略，以應對免疫測試得出的不正確結果所造成的潛在損害。類風濕因子（rheumatoid factor），即針對人類IgG的Fc區域的人類抗體，具有類似的效果，可以阻斷待測物與試劑的結合或交聯測試試劑，特別是當試劑是人源的時候（例如，用抗體藥物作為測試試劑進行ADA檢測）。

干擾也可以來自于待測物或測試試劑的變化甚至降解，從而導致檢測信號的降低。當測試試劑可以結合到微孔板的表面或其它測試平臺上類似的表面的時候，會不真實地增加測試信號。最后，當樣本的采集或處理過程引入了不反映所涉及生物體液中待測物濃度的額外待測物時，待測物本身也就產生干擾（見圖1）。同樣，非常高濃度的待測物可以通過所謂的鉤狀效應抑制測試信號。

圖1.免疫測試中的基質干擾；HAMA：人抗鼠抗體; int.：干擾分子; RF：類風濕因子

在支持臨床前和臨床研究的LBA方法中，可以在檢測研究樣本之前評估大多數的干擾。這種評估和減輕干擾的過程是定量分析方法開發的一個重要組成部分，通常可以通過一些簡單的實驗來揭示干擾的存在。

平行性/線性和加標樣品的回收率

通常可以通過測試樣品的連續稀釋來揭示干擾的存在。對不同程度的樣本稀釋，干擾很可能會導致所測定的濃度（dilution-adjusted concentration）的變化或不同。在大多數測試中，這種并行性的缺乏通常在較高的稀釋倍數下會消失，表明干擾是由一個基質組分引起的。因此，如果在高濃度的情況下出現不平行性,干擾很可能是由于高濃度的干擾性基質成分，能夠以高親和力結合待測物或測試試劑的基質成分，或標準參考（比）物與內源性待測物之間的差異引起的。

嚴格地說，后一種情況不是干擾，而是表明標準參考（比）物不適合用于定量內源性待測物。在這種情況下，測試方法只是準（半）定量的。當一定量的待測物加入到樣品中時，不受干擾的分析方法應該能夠對加入量進行定量（回收率=100% + 誤差），基質干擾往往會導致外加待測物的回收率降低，即<100%。如果內源性待測物與添加的待測物的性質不同，如重組蛋白vs內源性蛋白，回收率本身只能作為干擾的一個指示。<>

阻斷干擾和特異性的相互作用

如果測試信號在添加阻斷試劑（例如阻斷緩沖液/ blocking buffers或heterophile阻斷試劑）后發生變化，則可能存在因測試試劑之間的相互作用或固體載體引起的基質干擾。阻斷試劑與稀釋研究已被用于篩查干擾的類型，使用特異性試劑阻斷待測物可能會揭示非特異性信號，因為特異性阻斷試劑應該使得特異性信號的完全喪失。如果測試信號或一部分信號在使用阻斷試劑后仍然存在，這就意味著存在干擾。

研究結果評估

即使經過嚴謹的分析方法開發，測試研究樣本時也會出現干擾，有時是因抗體藥物或聯合用藥導致的基質變化所引起的。出現干擾的指示是測試結果與給藥后的預期效果不一致，特別是在研究的過程中，比較個體的PK，PD和免疫原性數據時。相關的檢測結果不一致也是存在干擾的一個重要指示，然而關于研究結果是否有效的結論則應該謹慎，出乎預料的結果很有可能也是有效的。

下一節將討論在可溶性蛋白生物標志物，抗體藥物和ADA測試中觀察到的干擾。

可溶性蛋白生物標記物的定量分析已成為藥物開發的基石，并為藥物開發過程中的安全性、有效性、PD和作用機制的評估提供重要信息。血液循環或尿液中的可溶性蛋白質樣本很容易獲得，在臨床上作為常規的診斷性測試（diagnostic assays）使用，或用于預測患者對藥物的反應。在這個領域中，診斷測試中存在干擾是公認的，因此完全依賴某一個測試結果可能導致誤診。

一個明顯的例子是在診斷性人絨毛膜促性腺激素檢測（diagnostic human chorionic gonadotropin assay）中，最可能由heterophilic抗體干擾引起的假陽性結果導致了不必要的，包括外科手術和化療的治療性干預。用于支持測試方法開發的研究的聚焦點（focus）和深度（depth），取決于該方法的預期目的，因而出現“符合其用途（fit-for-purpose）的方法開發”這個術語。

關于生物標志物的分析方法開發和驗證，通用指南的發布極大地推進了生物標志物檢測的方法開發和驗證的實踐。本文關注的焦點在于測試方法對測試結果的干擾。

樣本采集和處理

從血細胞中非特異性地釋放待測物可能發生在涉及血液基質的樣品采集或處理過程中，如果可溶性蛋白生物標志物出現這種情況，就會導致待測物濃度的假性升高以及測試結果的變異性增加。例如，在測定PDGF或VEGF等生長因子時，應注意選擇最合適的樣本類型，以避免樣本的處理過程非特異性地激活血小板并釋放蛋白質進入到樣本中。對于這些待測物，血漿是比血清更合適的樣本基質。

有研究表明，在分析前樣本的處理過程中，室溫保存會顯著改變血液樣本中IL-8的濃度。室溫孵育會產生更多的IL-8，導致血液裂解液（blood lysate）樣本中IL-8的濃度不真實地增加。采集后立即將樣品保存在冰上，而不是室溫下，可以減少這種影響。紅細胞部分溶解(溶血hemolysis)的血清或血漿樣本并不少見，如果紅細胞含有高濃度的待測物的話(例如，aspartate transaminase)，則會導致待測物的錯誤數值。

蛋白質的構象可以影響檢測試劑的檢測能力，這可能由測試緩沖液中的成分引起。例如，血漿中鈣的螯合作用已被證明會影響對鈣結合蛋白S100A12的檢測。這樣的干擾可以通過使用不依賴于陽離子結合而能檢測待測物的檢測試劑，或在樣本中加入陽離子，或選擇不引起金屬螯合的樣本制備方法（例如肝素鈉血漿或血清）來減輕。

在某些情況下，樣本的物理特性會使移液變得困難，這種情況或將在測試過程中引入干擾。例如，痰的粘度很高，以至于不能實現精確的移液。通過對常規的痰液采用黏液溶解劑dithiothreitol處理，可以降低總粘度；同時，還必須考慮dithiothreitol的濃度及其對免疫測試試劑和待測物完整性的潛在影響。

此外，一些血漿或尿液樣本中不溶性沉淀物引起的高渾濁度會引入干擾或高背景信號，可以通過離心或過濾來減少沉淀物，諸如此類的方法可以減少基質干擾，并盡量減少由機械性錯誤引起的誤差。

特異性

如上所述，對分析方法特異性的錯誤解釋是基質干擾的主要原因。一個可溶性蛋白生物標志物可能有不同的高度同源的家族成員，異構體或前體蛋白（precursor proteins）。如果一個結構上與實際待測物相關的蛋白質，而且免疫分析系統中的捕獲試劑和檢測試劑都能識別，那它就會導致可溶性蛋白生物標志物出現錯誤的高濃度結果（例如，一種商用的PDGF-BB測試方法也檢測到10%的PDGF-AB）。

Periostin是嗜酸性氣道炎癥的生物標志物，具有多種亞型；在分析方法的開發過程中，明確定義了該方法對于這些異構體的特異性。一些用于medullary thyroid carcinoma診斷的calcitonin分析方法，似乎也部分檢測到了pro-calcitonin，但后者對于medullary thyroid carcinoma沒有診斷價值。

如果只有捕獲試劑（或均相分析中的檢測試劑）與待測物相關的蛋白質結合，則可能導致待測物的錯誤的低測定值。可以通過了解相關生物系統來理解和管理這樣的干擾。例如：確定潛在的交叉反應因子及其相對濃度和親和性、選擇對待測物盡可能特異性的試劑、稀釋樣品（其可能將相關干擾蛋白的濃度降低到測試方法的檢出限以下）。

另一種可能的方法是通過添加一種特定的試劑來消耗或中和系統中的干擾異構體或家族成員蛋白，這種試劑只壓制（suppression）相關蛋白，而不壓制待測物本身。

結合蛋白

可溶性受體或其它直接與待測物結合的蛋白質的存在可能導致分析信號的改變，因為它們可能在LBA測試中，阻斷或加強與捕獲或檢測試劑的相互作用。例如，IL-6可與IL-6R和gp130形成復合物，可根據檢測試劑的不同，可以檢測到不同性質的IL-6。通過選擇測試試劑，其結合待測物，但不與樣本中干擾蛋白競爭結合位點，則可以減少可溶性受體或結合蛋白引起的干擾，特別是當引起干擾的相互作用的親和力低時，稀釋可以減少干擾。如果不可行，其他可能的方法涉及破壞待測物和結合蛋白或可溶性受體之間的結合。例如，酸解離可以從類胰島素生長因子與其結合蛋白的復合物中解離出類胰島素生長因子，在中和樣本之前加入結合蛋白的抑制劑可以進一步減少干擾。

對此類樣本預處理，應嚴格評估其對測試試劑或待測物表位的影響。由于此類基質干擾可能難以完全消除，因此，最重要的是了解測試試劑的特異性以及檢測到的待測物的各種復合物，以便據此解釋測試結果。

內源性抗體

如前所述，heterophilic抗體和抗動物抗體可以結合主要是動物來源的抗體測試試劑；從而導致不真實的高或低結果。人抗小鼠抗體是最常見的人抗動物抗體類型，可以結合夾心式LBA方法中的捕獲和/或檢測試劑（取決于產生試劑的物種）。與這兩種試劑結合會導致試劑橋接和特定待測物的假陽性結果；與其中的一種結合，則可能會破壞待測物的結合并導致假陰性結果。減少heterophilic抗體或人抗動物抗體干擾的最常見方法是添加動物免疫球蛋白（純化或來自正常動物血清中的）或其他商用試劑（例如heterophile的阻斷劑），這些試劑對heterophilic抗體具有特異的活性。

此外，對蛋白質生物標記的抗體（自體抗體autoantibodies）可能導致錯誤的低或高信號。例如，針對thyroxine的自體抗體，存在于Hashimoto’s thyroiditis等疾病中，并在一個thyroxine競爭性免疫測試方法中與fluorescein-T4示蹤劑結合，導致thyroxine測定值偏低。

均相的測定方法（homogenous assays）可能比sequential assays更容易受到這種干擾。選擇來自兩個不同物種的試劑來捕獲和檢測待測物，也可能有助于減少人抗動物抗體的橋接干擾。另一種方法是對樣本進行足夠的稀釋以消除干擾。使用G蛋白去除干擾抗體，或使用detergent破壞嗜異性抗體的相互作用。這些和其它改變樣本的處理可能會產生問題，因為它們可能會意外地移除待測物或影響測試試劑。

其它樣品成分

歷史上，測定吸光度或光散射的臨床測試方法受高脂(脂血癥lipidemia)或膽紅素(黃疸icterus)樣本的影響，而LBA方法則不受影響。然而，膽紅素降低了一個檢測b型人絨毛膜促性腺激素和IgG的商業化的檢測方法所測定的數值，干擾可能來自預料之外的地方。

例如，胰腺囊腫液中的蛋白酶可以降解待測物和試劑抗體，蛋白酶也被懷疑干擾了痰標本中IL-5的檢測，因為添加蛋白酶抑制劑增加了IL-5的檢測數值。有趣的是，在使用治療劑量后，發現樣本中的biotin對幾個測試方法產生了巨量干擾。

游離和總體靶標分析是針對可溶性抗原抗體藥物最常用的靶標結合生物標志物。如果一個靶標的可溶性形式進入血液，或者膜結合靶標的可溶性異構體可能存在于血液循環中，則游離和總體靶標分析數據也可作為針對膜抗原抗體的替代靶標結合生物標志物。

抗體藥物對游離的靶標的壓制（suppression）是衡量靶標結合效的直接表現。使用抗體藥物治療后，由于與抗體藥物結合后靶標清除率降低，總體靶標通常在血液循環系統中累積。由于靶標結合與其清除率之間的這種關系，靶標總數間接地說明了靶標的結合程度。此外，從總體靶標累積的數據，可以通過PK/PD模擬對游離靶標的壓制。定量分析游離和總體靶標，除了面臨所有對可溶性蛋白生物標志物的挑戰外，還面臨獨特的挑戰。

關鍵術語

游離可溶性靶標的定量方法：衡量靶標參與度的測試方法。由于游離的藥物和與藥物靶標結合的藥物之間的動態平衡在樣本孵育過程中發生變化，這種測定方法尤其受到檢測程序本身的干擾。

游離可溶性靶標的分析方法

大多數測定游離可溶性靶點的方法都是基于捕獲試劑與抗體藥物競爭與靶點結合的原理。測試方法的特異性和對靶標生物學的理解是建立可靠的游離靶標分析方法的關鍵。預期對這類方法的干擾與先前討論的生物標志物方法相同。此外，游離靶標的定量還會受到與方法的特異性，樣本稀釋，抗體藥物/靶標復合物的無意解離、孵育時間和捕獲試劑的濃度相關的干擾。

對游離靶標的定量分析中，靶標可能不僅與抗體藥物結合，而且還與內源的可溶性受體或結合蛋白相互作用。在某些情況下，它們與靶標結合的親和力與抗體藥物相當。此外，靶標蛋白的不同亞型不一定與抗體藥物結合，因而不一定被被檢測到。

確認一個方法能檢測到的靶標組分（fraction of target）是至關重要的。它既可以是未結合抗體藥物的組分（therapeutic antibody-unbound fraction），也可以是未結合抗體藥物和結合蛋白的組分（the binding protein- and therapeutic antibody-unbound fraction）。在這兩種情況下，可能有必要在研究期間評估結合蛋白水平的變化，以適當地解釋數據。此外，了解結合蛋白是否抑制靶標蛋白以及結合蛋白是否與藥物抗體競爭與靶標蛋白的結合，也是至關重要的，由于一些靶標擁有多個結合蛋白，因此應該將體外結合實驗的重點放在對游離靶標結果有影響的結合蛋白上。

許多LBA方法依靠稀釋樣本來減少未知來源的基質干擾。在游離靶標的分析中，稀釋樣本改變了游離靶標與藥物結合的靶標以及與血液循環中結合蛋白或可溶性受體結合的靶標之間的動態平衡。此問題有兩種解決方案：1.開發不需要稀釋樣本的分析方法; 2.稀釋樣本并恰當地報告結果。如果可行，始終優先考慮在未稀釋的樣本中定量分析游離的靶標。

在未稀釋的樣本中消除基質干擾是一項困難的工作，因為生物基質是復雜的，并且在血漿和血清中總蛋白濃度很高。測量未稀釋樣本的一種方法是使用與樣本基質相似的緩沖液制備標準曲線，這將導致對標準曲線和樣本相同的基質效應，因此測試結果不會受基質的影響。這個方法只有在單個樣本之間的基質干擾相對穩定的情況下才會有效，生成這種測試基質最準確的方法是將所有待測物消耗掉，并避免depleting reagent進入樣本基質。使用來自其它物種的血清或血漿（例如，胎牛血清）通常是足夠的，因為它們不與捕獲試劑結合，或者在均相分析中也不與檢測試劑結合。從操作的角度來看，未稀釋的血清或血漿樣品是粘稠的，在移液和稀釋過程中需要格外小心，以確保測試的準確度和精密度。

從稀釋的樣本中準確地得出游離待測物的濃度也具有一定的可能性。在一個雙組分系統中，抗體藥物和親和力與豐度是已知的，因此可以預估對稀釋樣本中待測物濃度的影響。對于平衡擾動對測定游離激素的影響有詳細的研究。圖2顯示了一個簡單的、在不同的靶標/抗體藥物比值下樣本稀釋的模擬。對于親和力為0.1nM的典型抗體，靶標濃度為5 nM，對于靶標/抗體藥物結合位點(CDR互補性確定區域)比例為1:3或更高的情況，未經稀釋調整的濃度是相當準確的。對于CDR與靶標濃度比值較高的樣本，較高的稀釋度對未調整稀釋的濃度（non-dilution-adjusted concentration）的影響不大。也可以通過模擬不同體內情況下的體外實驗來驗證數據報告的策略。對于在藥物wash-out period結束時收集的樣本，即當抗體藥物和靶標濃度趨于一致時，報告未稀釋調整的數據將是不準確。在上面的例子中，當CDR與靶標的摩爾比值為1:1時，未經稀釋調整的數據是不準確的。在相關研究中，必須定義一個客觀標準，只在合適的時間點報告未經稀釋調整的濃度數據。

圖2. 在不同靶標-抗體濃度比值下，樣本稀釋對游離靶標的濃度的影響。假設：解離常數（KD）= 0.1 nM；樣本中的待測物濃度為5 nM；抗體藥物的CDR是1-，3-，10-，30-或100-倍于靶標的摩爾濃度

此外，測試試劑會引入一個誤差，因為結合的和游離的靶標之間的動態平衡會發生漂移（當存在額外的結合試劑，即捕獲試劑的時候）。這種所謂的觀察者效應（observer effect）解釋了一個物理原理：觀察的行為會改變被觀察的現象。

雖然這一原理與可溶性蛋白生物標志物的定量分析幾乎無關；然而，這一原理卻非常適用于游離靶標的定量分析，在總體靶標濃度高、游離靶標濃度低的樣本中體現得尤其如此。在抗體藥物給藥后，由于與抗體結合后靶標的系統清除率降低，總體靶標常在血液循環系統中累積。

對游離靶標最佳的定量分析方法應該使用最少量的捕獲試劑和較短的孵育時間，以最小化對平衡的干擾。然而，這種方法降低了測試方法的精密度、穩健性和線性范圍。因此，最好研究觀察者效應的程度，并在游離靶標分析的準確度和實用性之間找到一個平衡。

如果捕獲試劑與抗體藥物相同或非常相似，ADA就會干擾游離靶標的定量。在這種情況下，ADA不僅與抗體藥物結合，而且還結合并阻斷捕獲試劑，因此很少或沒有游離靶標能與捕獲試劑結合，導致游離靶標的濃度大幅降低。這一效應可能導致即使在沒有抗體藥物的情況下，靶標也被壓制的假象，有鑒于此，應當避免將抗體藥物作為捕獲試劑使用。

在藥物開發早期，可能沒有合適的試劑。如果抗體藥物的免疫原性非常低，或者是單劑量給藥的研究，在免疫系統開始產生ADA之前抗體藥物就被清除了，則可以將抗體藥物作為捕獲試劑。亦可將ADA為陽性的個人的游離靶標數據排除在最終的數據分析之外。此外，在臨床前研究中，可以從樣本中剔除包括潛在的ADA在內的動物抗體。

可溶性靶標總量的分析方法

抗體藥物經常干擾可溶性靶標總量的測定。即使捕獲和檢測抗體的表位與抗體藥物的表位都不重疊，仍然經常會出現干擾。抗體藥物可能改變靶標的構象或與兩個靶標分子交聯（crosslink），導致靶標總量的高估或低估。為了規避這一效應，可以在樣本中加入過量的抗體藥物，將所有游離的可溶性靶標轉化為藥物-靶標復合物。添加過量的抗體藥物后，就可以使用針對靶標-藥物復合物的定量分析系統來測定靶標總量。在這種情況下，ADA可能結合抗體藥物造成干擾，可通過形成多聚體復合物（multimeric complexes）來阻斷檢測（inhibit detection）或放大特定的檢測信號。

Salimi-Moosavi等人證明，研究樣本的堿性或酸性/guanidine 處理均可將抗體藥物產生不可逆變性，而靶標在樣本中和后，則可恢復免疫反應性。這樣的預處理能有效地消除抗體藥物的所有干擾（這種方法能廣泛應用于其他蛋白靶標和抗體藥物，那將會很有意義）。

另一種方法是將僅使用一種非競爭性抗體和治療性抗體作為試劑，使用非競爭性抗體捕獲靶點游離或結合在治療性抗體上。靶標和治療性抗體,然后篩選了酸、中和和涂布到聚苯乙烯板上。進而用標記的治療性抗體檢測被包裹的靶點。

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