此前，“袁來如此”專欄就抗體藥物和靶標生物分析數據的具體應用以及mAb和L的結合可能產生的問題展開了詳細介紹(袁來如此｜大分子生物分析概論（七_）上：LBA測定抗體藥物與其靶標的總/游離濃度)，本期將延續上期內容，重點關注抗體藥物的定量和靶配體的生物分析方法。

“袁來如此”專欄系廣州博濟醫藥微信公眾號打造的科普學術專欄，內容均為博濟醫藥子公司深圳博瑞副總經理袁智博士原創。

雖然可以設計LBA用來測量mAbfree或mAbtotal，但受試劑限制、樣本稀釋等影響，并不能確定該方法是否僅僅測定mAbfree。因此，可以采取測定mAbtotal的策略。mAbtotal和mAbfree的分析方法見表6，典型的ELISA檢測格式見圖2。

表6. 設計用于測定推定的總體和游離的單克隆抗體的測試格式

圖 2. 典型的測定mAbtotal或mAbfree的ELISA示意圖。mAbtotal的測定方法：a. mAbtotal：捕獲抗體non-inhibitory anti-CDR，檢測抗體anti-hu IgG。b. mAbtotal：與L預孵育轉化為mAbtotal-L，捕獲抗體non-inhibitory anti-L，檢測抗體anti-human IgG 或non-inhibitory anti-CDR。mAbfree的分析方法：c.二價mAbfree:與L作為捕獲及檢測的橋接分析方法。d.用于二價和單價的mAbtotal-L的捕獲與檢測。

通用格式:用于測量mAbtotal

由于特異性試劑通常是不可及的，所以在臨床前階段通常采用測定mAbtotal的“通用”分析方法。為了與試驗物種IgGs的交叉反應最小化，可以使用抗輕鏈（anti-light-chain）和/或亞型特異性（subclass-specific）試劑（例如圖2的a、b使用抗Fc試劑）。同樣的方法可以用于多種動物和不同的候選藥物，但是對于每個物種，仍然需要驗證每個mAb方法。

“通用”分析方法可以作為一種“現成的（off-the-shelf）”方法使用，在早期開發中，僅需要很少的優化（在確定特定的測試試劑之前）。然而，這種格式的分析方法不適用于臨床樣本的檢測，因為其中含有mg/mL級別的人體內源性IgG的干擾，需要外加待測物，回收實驗評價來確認無內源性組分的干擾。此外，該方法對活性（active）mAb藥物沒有特異性，但可能會與變性了的（denatured）、化學或蛋白酶降解后的mAb發生反應。

互補配對格式:用于mAbtotal或mAbfree的分析

互補配對的格式使用的非抑制性抗CDR抗體試劑（抗體試劑識別mAb超可變區域上不參與L結合位點的抗原表位）和通用試劑方法是一種可以用于臨床樣本的檢測方法（例如,圖2a使用anti-mAb試劑）。在臨床樣本中，這種互補決定區域(complementarity-determining regions，CDR)的抗原表位不會出現在內源性人類IgG上。但是卻很難獲得這樣的non-inhibitory anti-CDR mAb試劑。另外，如果使用多克隆抗體試劑，在藥物開發項目的生命周期中，維護試劑批次間的一致性也是一個挑戰。

對特異于mAbfree的測試格式，一對試劑中至少有一個試劑必須與待測物的同一位點結合。這些試劑可能是與L競爭結合的anti-idiotypic抗體（即inhibitory anti-ids）或者是L本身（圖2c， d）。這種分析方式的一個變種源自試劑的組合應用（例如，“橋接bridging”格式中，使用相同的試劑捕獲和檢測mAb，L作為捕獲試劑，與anti-idiotypic抗體進行結合檢測，反之亦然）。橋接格式的一個優點是為了能夠被檢測到，mAb必須要有兩個functionally free結合位點。使用L的捕獲方式要求mAb只有一個供檢測的游離結合位點，并且對游離和部分游離的藥物都有特異性。但分析結果并沒有揭示這兩種形式的相對比例。

圖 2. 典型的測定mAbtotal或mAbfree的ELISA示意圖

在mAbfree的競爭式分析格式中，標記的mAb（例如biotin或horseradish peroxidase標記的）允許與樣本中未標記的mAb競爭，以結合特定的捕獲試劑。標記的mAb的數量將與樣本中mAb的數量成反比。但是競爭式方法可能不如非競爭式方法的穩健性好。

獲得mAbfree真正價值的挑戰

雖然mAbfree代表擁有物活性的形式，是藥代動力學家們的首選，但實際上，即使是設計良好的分析方法，對體內mAbfree濃度的定量也存在著挑戰性。正如《結合平衡和對mAbtotal/mAbfree分析方法的挑戰》中所討論的，樣品采集條件、處理過程或分析方法都可以對平衡做出干擾影響，改變mAbfree的比例。

作為替代方法，樣品中mAbfree、Lfree和mAb-L的濃度可由mAbtotal和Ltotal來計算。但是計算是以平衡方程為基礎的，這需要對體內平衡解離常數（Kd）有很好的估算。因為動態平衡將隨著不同的mAb和相應的L濃度而發生變化，所以需要在存在過量L的情況下檢測mAb，然后根據經驗判定它確實是mAbtotal或mAbfree的測試方法。

圖3展示了測試L對mAb干擾的示例。以不同的摩爾比預孵育L和mAb，達到平衡后，用特定ELISA來測定mAb的濃度。以L/mAb的摩爾比為X軸，抑制率為Y軸繪圖。對于mAbfree的測定，IC50將接近1。但需要注意的是，用于測試的重組L可能不能完全與其內源性形式一樣地結合mAbfree，而導致IC50偏離真實值。

圖 3. L干擾mAb的測試。a. mAbfree的分析方法的示例：L/mAb摩爾比在大約0.7時的抑制率為50%；b. mAbtotal的分析方法的示例：L/mAb摩爾比約為300時，抑制率為50%。

此外，選擇一致和穩健的分析方法來支持mAb產品的臨床開發也很重要。如果需要改變方法，應同時使用外加藥物的樣本和真實的研究樣本進行方法比較，以確定改變分析方法對PK數據的影響。

總靶標配體(Ltotal)的分析方法

Ltotal展示了有關mAb對L累積的影響的信息。由于mAb的半衰期通常比循環系統中L的半衰期長，給藥后形成的mAb-L可能不會像Lfree那樣快速清除。此外，在某些情況下，作為給藥后的響應，膜受體形式中L表達的上調或可溶性L的合成可能增加血液循環中L的濃度。

用于Ltotal的分析方法有多種。表7列舉了相關方法并總結了這些方法的應用和局限性。

表7.臨床前和臨床開發階段中，測定Ltotal的方法

典型的用于Ltotal的分析方法如圖4所示。為了測定Ltotal，可以使用針對與mAb不同的特異性抗原表位的抗L抗體（非抑制性）(圖4b)。在這種方法中，如果抗L試劑與mAb的識別區域重疊，mAb可能會干擾分析，導致檢測值偏低。相反，mAb可能與L形成復合物，并增強檢測信號，導致檢測值偏高。對于分析Ltotal來說，稀釋樣本可能會增加mAb-L復合物的解離，也可使用預處理將結合型的L轉化為Lfree(圖4a)。分離方法（dissociation methods）取決于mAb對于L的變性（relative denaturation）。

圖4.典型的Ltotal夾心式ELISA方法示意圖. a. 實驗前的預處理解離mAb-L復合物。B. 未進行預處理解離。符號與圖2a、b相同。

游離靶標配體Lfree的分析方法

在給藥過程中，監測Lfree對確定有效劑量具有重要意義。試劑的選擇對Lfree分析的影響與對mAbfree相似，但更加復雜。在許多情況下，與膜結合的L相比，組織中的可溶性L含量較低，可能需要高靈敏度的分析方法來測定Lfree的正常水平。在大多數情況下，mAb/L的高摩爾比對給藥后Lfree定量分析的準確度造成了一定的阻礙。但即便如此，仍可獲得Lfree的相對趨勢，以提供有關mAb的影響和維持所需的Lfree水平等有價值的信息。

表8總結了臨床前和臨床階段用于測定Lfree的方法，圖5展示了典型的測定Lfree的分析方法。特異性的抑制性抗L抗體或mAb（或mAb模擬物）可作為捕獲試劑，而特異性的非抑制性抗L抗體可作為檢測試劑（圖5a）。但是解離結合形式的L（bound form of L）的樣本處理步驟和分析條件可能會導致檢測值偏高(見《結合平衡和總/游離型分析的挑戰》)。

表8. 測定游離靶標配體的方法

圖5. 典型的測定Lfree的夾心式ELISA示意圖。a.無預處理分離；b.在ELISA之前，使用μ-affinity柱子分離游離的和結合的L。符號與圖2a、b中相同。

另一種方法是通過分子篩、固相萃取或親和分離法，在LBA分析之前，去除結合形式的L(圖5b，如使用G蛋白、A蛋白或抗人FC柱)。然而，由于柱子或過濾器表面的吸附作用，這些額外的步驟可能會帶來誤差，而且在這些分離過程中也可能會發生解離。因此，Lfree的數據只能顯示出相對的趨勢，而不能作為絕對的定量結果。

在使用樣本制備方法開發Ltotal和Lfree測定方法的時候，需要重點評估在預期濃度范圍內的Lrecovery（L的回收率）以及在預期有或沒有mAb的基質中，評估來自樣本基質和其它相關結合蛋白的干擾。重要的是要確認在使用最終方法時測定的值是Ltotal還是Lfree。可以采用不同mAb/L摩爾比進行干擾測試，類似于圖3所示的實驗。

圖 3. L干擾mAb的測試

靶標配體的相對測定方法

測定靶標配體 (Ltotal或者Lfree)可以提供一些重要的信息，包括證明mAb與L的體內結合、靶點占用率、有效的mAb濃度以及PK/PD關系。

測定L的準確度取決于標準參照（比）物和試劑的質量。當不能獲得內源性L的標準參照（比）物時，可以使用重組或合成的L標準參照（比）物。定量的準確度取決于標準參照（比）物與內源性待測物這二者與測試試劑結合的相對活性（relative binding activity）。

在分析方法驗證的過程中，應評估Ltotal的平行性，以確定該方法是否能像標準參照（比）物一樣識別內源性的L。如果缺乏平行性數據，該分析方法只能是半定量的，所產生的數據必須在此背景下進行解釋。當沒有足夠高濃度的內源性L樣本來評估平行性時，解釋數據時應該謹慎使用絕對濃度這樣的術語。在這種情況下，L的相對變化趨勢將更加可靠。

為了適當地使用和解釋生物分析數據，了解數據的可靠性和局限性是至關重要的。在LBA方法中，捕獲和檢測試劑是決定該方法的特異性（針對游離的、結合的或總濃度的特異性）的關鍵組成成分。理解mAb/L的比值和動態平衡對于選擇最合適的格式進行方法開發是至關重要的。

此外，在疾病模型或特定患者群體中，靶標配體的狀況可能與健康對照群體有著非常不同的情況，所以了解在不同物種和疾病狀態中出現的mAb/L比值的可變性也很重要。即使擁有高度表征的試劑，也應該理解mAb-L在體內是以動態平衡的方式存在的，因此體外（ex vivo）的測試條件（例如樣本稀釋和孵育時間）會影響mAb和L的定量以及它們兩者之間的平衡，可以通過研究mAb-L平衡，分析操作步驟，評估實驗結果，來判斷它們是否真實反映了研究樣本中的結合關系（binding relationships）。本文的表格中所列出的樣品處理策略和定量方法，經常適用于方法開發，其目的是定量分析游離（free）的、總體（total）的和結合了（bound）的mAb和L的各種形式。

mAb和L的濃度數據一般用來在藥物開發的不同階段幫助做出具體的決策。在臨床前研究中，可能沒有相關試劑用于開發定量mAbfree的方法。mAbfree和mAbtotal（當沒有檢測mAbfree的方法時）的定量數據將用于評估系統暴露量-時間過程與毒性研究結果的關系，并預測人體起始劑量的安全余量。通常情況下，mAb給藥的劑量會使得血液中mAb的濃度遠超L，因而mAbtotal與mAbfree相近并可以作為mAb活性的指標，進而基于PK-PD模型計算來決定采用多大劑量。

在臨床評估中，會使用特定試劑測定mAbfree或mAbtotal以描述mAb藥物在人體中的分布情況，并將mAb的暴露量與其安全性和有效性聯系起來。同時，也有助于更好地理解mAb-L的動力學，為后期臨床研究時選擇給藥方案提供相關信息。

在藥物開發中，越來越多的研究人員選擇使用靶標配體（L）的濃度數據來指導決策。例如，Lfree的數據可用于指導給藥劑量和頻率的選擇。對L動力學的理解有助于確定維持受體占用率所需的mAbfree的有效濃度。在許多情況下，由于Lfree的濃度很低，并且可能隨分析條件的變化而變化，定量數據可能是不可靠的。

另一種方法是考查給藥后Lfree的變化趨勢，而不是依賴其絕對值。Ltotal提供了mAb活性的證據，此外，如果mAb–L的結合改變了靶點表達量(例如L的高度積累)，可能需要提醒研究人員注意安全性的問題。可以在PK/PD模型中，使用Ltotal來推斷Lfree的濃度。根據Ltotal、Lfree以及mAbfree或者mAbtotal的適當信息，通過PK/PD建模來估計Lfree的體內結合親和力和抑制作用，這可能有助于給藥劑量和頻率的選擇。

由于待測物的形態(游離/總/復合，free/total/complex)和用于定量這些形態的生物分析方法會影響藥物暴露量-時間過程的確定，因此在整個藥物開發計劃的背景下，對生物分析數據的解釋保持一致是至關重要的。

此外，設計能夠解決相關科學問題的生物分析方法也很重要。由于每個靶標及其相關疾病生物學的復雜性和獨特性，應與數據的最終用戶協商，為每個藥物開發項目精心制定定量相關形式的生物分析策略，并考慮藥物靶標生物學、藥物開發階段和包括試劑可及性在內的實際挑戰。當前滿足所有要求且令人滿意的生物分析方法少之又少，還需要更多的努力來開發相關方法，所以目前大多數情況下只能使用不太理想的分析方法來支持藥物開發的某個階段。在這種情況下，應該清楚地向所有利益攸關方傳達使用不太理想的分析方法時的注意事項、對數據的影響和項目的相關風險，以確保做出恰當的決策。

在一些文獻中，有些學者使用串聯高效色譜-質譜(LC-MS/MS)方法來定量mAb。此種方法涉及酶消化，將mAb轉化成小的肽段（以保持在一定的質荷比范圍內）。需要注意的是，mAb必須在酶消化前變性，確保mAb與L的分離。因此，LC-MS/MS方法可用于定量mAbtotal。用于蛋白質定量的LC-MS/MS方法將在后續文章中探討。

雖然本文所述的問題和例子可適用于多種類型的生物藥，但為了明確起見，本文重點關注的是mAb及其相關的靶標配體L。對于其它生物藥的復雜性，如蛋白質、肽和寡核苷酸及其相互作用，還需要進一步考慮擴展這里提出的概念，并在未來探討。

就實際的分析方法開發和結果數據的適當運用而言，提出明確和果斷的建議是一個巨大的挑戰。本文試圖確定在藥物開發的每個階段數據的合用性，以便開發可以用于特定目的的定量分析方法。更重要的是強調了分析方法的局限性（對于適當地解釋和使用數據而言）。后續有機會將繼續探討mAbs和非mAbs生物藥的相關問題和挑戰，如結合mAb的抗藥物抗體（ADA），敬請關注。

特別聲明

本文如有疏漏和誤讀相關指南和數據的地方，請讀者評論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經發表學術期刊、 官方網絡報道等公開渠道, 不涉及任何保密信息。參考文獻的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價值的文獻及其評估。

擴展閱讀