此前，“袁來如此”專欄就LBA定量方法的監管驗證展開了第一、二期的詳細介紹，本期將延續前兩期的內容，繼續分享后續相關內容。
1.精密度和準確度
在方法開發之前或期間，應確定最低可接受的準確度和精密度，并在該分析方法的生命周期內使用，同時應用適當的統計方法計算運行內和運行間的精密度（precision）和方法準確度（平均偏差mean bias）。表 VII A 中提供了適用于方法開發和研究前驗證數據計算的示例，表 VII B提供了相關公式。
表 VII A . 準確度和精密度的示例。重復多孔分析的結果來自一個蛋白藥物的免疫分析數據。在Excel電子表格中，使用方差分析（ANOVA）計算了相關統計結果。所有數據的符號表示法在表VII B中列出。
表 VII B.表VII A.中數字示例的符號表示法
運行內精密度：從計算的運行平均值，估算測定濃度值的混合運行內標準方差（SW）。總隨機誤差，通常稱為運行間精密度（或中間精密度intermediate precision），從所有運行的累積平均值，估算所有測定的濃度值的標準方差（）。如出現后一個標準方差稍微低估了真正的運行間的非精密度（imprecision），使用方差分析（ANOVA），則能夠計算更準確的數值 （SIP）（見表VII A）。
方法的準確度（表示為%RE）由加權樣品平均值（weighted sample mean）與樣品標稱參考值μT（sample nominal reference value， 50ng/mL in表VII A）的百分比偏差（percent deviation）確定。當所有分析運行的重復孔數相同時，加權平均值（weighted mean）和樣品總體平均值（ sample overall mean）相等，將標準方差除以樣品標稱值，即得出精密度，以%CV作單位記錄。
在某些應用場景中，例如當基質中存在內源性化合物且無法剔除時，則沒有標稱值可用；因此，必須用計算出的樣本平均值替換%CV計算中的標稱值。在這種情況下，在驗證之前，還必須科學合理地計算回收率，并將其用于評估準確度。
在方法開發的早期，可以計算校準品的%CV和平均RE，預測該分析方法可能達到的精密度和準確性的最佳值。
要得到預期分析性能更可靠的評估，可以獨立制備額外的加標對照樣本組，并至少進行3次分析運行。所制備的樣品的濃度應包括校準品的整個范圍（例如，6至9個濃度點），對每次運行中的每個濃度點，至少進行復孔（duplicate）測定。由內插計算得出的樣品濃度，將反映來自校準品的變異性、來自樣品制備和位置等其他因素的變異性。表VI中所建議的每個濃度的累積 %CV和絕對平均RE（平均偏差mean bias）的目標限度為20%（LLOQ為25%），這與研究前驗證評估時的精密度和準確性的目標限度相同。
在研究前驗證期間，可通過分析驗證樣品確認方法精密度和準確性。在預期未知樣本的基質中，制備5個或更多濃度的驗證樣品如下：預期的定量下限（LLOQ）、小于LLOQ的1/3的濃度、中濃度、高濃度和預期的定量上限（ULOQ），建議再進行最少6次分析，對每次運行的每個樣本至少進行2次獨立分析(復孔)。對于每個驗證樣品，應使用適當的統計方法一起分析所有運行的復孔測定值（請參閱表VII）。
如認為方法可以接受，建議運行間精密度（%CV）和絕對平均偏差（%RE）均須 ≤20%（LLOQ 為25%）。此外，建議將方法總誤差（%CV和絕對%RE的總和）定為≤30%（LLOQ為40%），以符合研究中驗證的接受標準。
每個研究中運行的精密度和準確性是通過評估QC樣品的分析結果來監控的。對于色譜類和LBA方法都采用同樣的運行接受標準：每個運行至少需要2/3的QC達到對應的標稱參考值的特定百分比（例如15%、20%、25%或 30%）；至少50%QC樣品的分析結果在指定的限度范圍內。對于傳統小分子藥物的定量分析，一般采用4-6-15規則，相比之下，在2000年3月的AAPS研討會上，建議對大分子的LBA制定4-6-30規則，本文建議采用4-6-30 規則。
建議采用研究前驗證部分中描述的精密度和準確度的接受標準，因其計算簡單，并與上述研究中的4-6-30 規則相當一致。根據定義，4-6-30 的接受標準僅基于單個定量結果與其標稱值的偏差，而不是基于計算的平均值或標準方差，由于分析結果與標稱值的偏差包括隨機誤差和系統誤差，因此它是一個總誤差的度量（圖4）。
圖4. 定量分析結果總誤差（z）的說明。總誤差定義為分析結果與其標稱“真實”值 (μT)的偏差（deviation）。一般假定均勻樣品的重復測定結果的誤差服從鐘形的正態分布。為便于比較，誤差通常表示為百分比相對誤差 (參見圖中刻度)；計算方法是將偏差除以標稱值，再乘以100。總誤差等于系統誤差的總和（systematic component，由計算出的分析平均值與標稱值的偏差來估計），再加上隨機誤差（random component，由一個分析結果與分析平均值的偏差來估計）。
附加的研究前驗證的限制條件，即%CV和絕對%RE的總和≤30%，以防止接受具有高度不精密（imprecision）和高度偏差（bias）的分析結果(例如接近20%)。這樣的分析方法往往不能通過4-6-30標準。其它確保研究前和研究中接受標準之間的一致性的統計方法亦可接受。
對于免疫測試和其它LBA方法，其定量范圍應基于最低（LLOQ）和最高（ULOQ），滿足目標精密度和準確度標準的驗證樣品，而不是校準品的性能。
用于定義定量范圍的驗證樣品是在未稀釋的樣本基質中制備的。在分析之前，它們可能需要進行最低限度的稀釋（minimal required dilution，MRD）。在需要使用 MRD 的情況下，可以將定量范圍定義為純粹基質中的標準濃度值，或者定義為應用 MRD 后獲得的標準濃度值范圍。例如在純粹基質中，10至100 ng/mL 的校準曲線等效于應用倍數為10的MRD（即10%基質）之后，1到10 ng/mL的校準曲線范圍。
在方法開發早期，可以使用回算的標準品濃度值初步估計定量范圍。稍后，則使用加標樣品來優化之前估計的定量范圍。在此階段，在預期的LLOQ和ULOQ濃度附近分析更多濃度點是有益的。精度剖面圖有助于評估定量范圍的預期極限（圖5）。
應根據外加待測物的驗證樣品（spiked validation sample）分析結果的精密度和準確性來建立該分析方法的定量范圍。標準曲線應包括跨越預期的LLOQ和ULOQ的濃度。LLOQ 和 ULOQ 由最低和最高的驗證樣本決定，其精密度（運行間%CV）和準確度（絕對%RE）均≤20%（LLOQ為25%），兩者的總和≤30%。
在研究前驗證時，確定的定量范圍是在必要時，樣本稀釋后必須達到的范圍。對高于ULOQ的樣本，必須增加稀釋的倍數后重新分析。如果樣本已達到最低稀釋要求，且低于最低定量限，則必須報告為＜LLOQ。在樣本分析期間，如果對標準曲線的必要編輯導致沒有標準品達到或低于經過驗證的LLOQ，則必須提升LLOQ。在這種情況下，需要將LLOQ上調到其余標準品中的最低濃度。
在研究前的驗證中，必須證明待測物在樣本基質中的穩定性。穩定性試驗應盡可能模擬研究樣本的收集、儲存和處理的條件。通常是將待測物添加到全血（whole blood）以及經過處理全血得到的基質，如通過血漿（plasma）和/或血清（serum）進行評估的。對制備和儲存條件的評估，通常包括工作臺穩定性（bench-top stability）、短期和長期穩定性以及多個凍融循環的穩定性。在確定操作條件時，應考慮分析物的理化性質，還必須建立待測物的初級標準溶液在相關存儲條件下的穩定性。
穩定性樣品必須與在與采集到的研究樣本相同的基質中制備。如果使用剝離或改變了的基質制備研究前校準樣品和QC樣品，則仍必須在未改變的基質中制備穩定性樣品。在分析方法開發過程中，制備穩定性樣品對研究前驗證期間的中、長期穩定性數據的收集有極大的積極作用。因此，在合適的實驗室中盡早制備穩定性樣品并保存相關文檔記錄，可以為建立待測物的長期穩定性提供一個良好的開端。穩定性評估可在方法開發過程中的樣本處理階段進行，包括但不限于對基質穩定性的評估：如室溫、凍融循環等，以確定在分析方法的整個生命周期中如何處理樣品。
正式的穩定性評估必須在研究前驗證中使用已建立的分析方法進行。制備穩定性樣品時，必須將待測物加入到與研究樣本相同的基質中，以產生高/低濃度的穩定性樣品，這些濃度可以與高/低QC濃度相同。建議使用與QC樣品相同的重復孔數來分析穩定性樣品。
評估工作臺穩定性時，要求處理樣品的方法與樣本收集（研究）和分析現場的處理方法相同，并且應在室溫(至少2小時)和冰箱溫度(2°至8°C)(至少24小時)下進行。研究人員可將分析物加入新鮮采集的全血來評估其全血穩定性。
以評估全血待測物穩定性為例，全血樣品中加入分析物，孵育2小時，每隔一段時間進行樣本處理以獲得血漿或血清；之后，監測處理后樣品的回收率的趨勢來評估其穩定性。
對于凍融穩定性評價，應考慮在常規分析中預期的凍融循環次數。標準的方法是3次凍融循環，每次解凍間隔不少于12小時。凍結和解凍的速度和冷凍儲存的溫度應該模擬樣品在分析前解凍時的處理方式。評估長期的穩定性必須考慮到樣本在研究現場和測試設施的儲存。在研究的整個生命周期中，包括研究樣本的分析完成之后，樣本都必須是穩定的。測試的時間間隔則取決于研究的需要，對于非常長期的研究，測試頻次以比樣本分析更密集，以確保可以分批次分析樣本，直到整個研究結束。
對于保存在-20°C和-70至-80°C樣品是否需要進行穩定性進行研究，可能取決于樣本在-20°C保存的時間。如果在-20°C冷凍樣本，在-80°C儲存，那么穩定性樣品應該以同樣的方式制備，在-20°C保存的時間可以建模，以預測其穩定性。
新鮮制備的標準校準曲線和QC樣品（無論是在可接受的失效期內或新鮮制備的），可以作為穩定樣品的比較標準。除了全血穩定性外，穩定性的接受標準與用于QC樣品準確度和精密度的接受標準相同。如果穩定性樣本的測定值在精密度的接受標準之內，那么樣本就被認為是穩定的，即便觀察到穩定性變化的某種趨勢，可以采用其他評估方法，如使用置信區間。在這種情況下，當觀測到的穩定性樣品的濃度或響應超出了置信區間的低端，則該樣本不再有效。
通常在研究中驗證期間，會繼續進行穩定性評估。如果研究樣品的處理和儲存條件發生變化，則必須進行額外的穩定性評估，以反映新的條件對穩定性的可能影響。如果無意中將樣品儲存在不同的溫度下，則應該在樣品分析之前進行該溫度下的穩定性研究，以確認穩定性，并通過更新方法驗證報告的形式進行書面體現。當一個時間點的穩定性數據表明樣本失穩時，只要有一個預先建立的、確認穩定性趨勢的方案, 則仍然可以在直到樣品失穩的時間點以內的時間段進行樣品分析；如果下一個穩定性時間點的樣本分析，否決了之前的樣本穩定性趨勢， 則可以延長樣本的穩定性區間。
由于許多免疫測試方法性質或格式中的標準曲線定量范圍(LLOQ到ULOQ)可能很窄，有時甚至<1個數量級。因此，有必要證明，當待測物的濃度超出定量范圍（高于ULOQ）時，可以稀釋樣本，使待測物的濃度進入經驗證的定量范圍。進行稀釋實驗的另一個原因是為了識別可能存在的“prozone”或“鉤狀效應”(參見圖6所示，即由高濃度待測物引起的信號抑制)。
稀釋線性（dilutional linearity）不應與平行性（parallelism）相混淆。平行性必須使用incurred sample，即已測樣本再分析的真實樣本，進行評估，而稀釋線性可以使用外加待測物的QC樣品進行評估。如果在研究前的驗證中顯示出稀釋線性，那么在研究中驗證時就不需要使用系列稀釋的QC樣品了。
圖6.鉤狀（Prozone）效應的演示。兩個結合點EIA的典型S形濃度-響應曲線(●)，包括高濃度鉤狀效應。具體來說，高濃度的待測物產生了低于預期的響應。如果沒有鉤狀效應，如開環(○)所示，較高的待測物濃度將產生 > ULOQ響應；如果沒有鉤狀效應，曲線的量化范圍在LLOQ和ULOQ之間。LLOQ和ULOQ之外的錨定點僅用于曲線擬合。
稀釋線性應在外加待測物到樣本基質中和隨后稀釋而制備的樣品上進行評估。該基質可以是單個樣本或單個樣本的混合物。選擇混合樣本和單個樣本取決于來自基質的物質，如嗜異性抗體（heterophilic antibody）或結合蛋白（binding protein）。稀釋倍數應使若干個稀釋后的濃度落在標準曲線的定量范圍內。
在評估稀釋線性時，應采用比ULOQ大100至1000倍濃度的加標樣品；如果不可行時，應努力使其濃度盡可能地高。制備的稀釋樣品應包括ULOQ以上的濃度(用于評估鉤狀效應)，以及校準曲線的高、中、低濃度（用于評估稀釋線性）。通常情況下，單次稀釋的倍數不超過1:100。
當稀釋線性度不足時，必須建立合適的分析高濃度樣本的策略。在報告測定結果之前，使用MRD或一個平臺值（plateau value）可以滿足這種需求。當無法實現稀釋線性時，也必須建立數據報告的策略，例如在校準曲線的定量范圍內采用最大的稀釋倍數。
在方法開發時建立的稀釋方案應在研究前驗證中加以確認，需要回算每個單次稀釋后的濃度，并計算經過所有稀釋次數的最終濃度的累積精密度。每個稀釋后樣本的回算濃度應在標稱值（nominal value）或期望值（expected value）的20%以內，累積回算濃度的精密度也應當≤20%。理論上，所制備1000倍于ULOQ的稀釋線性樣本應當得到一個大于ULOQ的回算值，但如果回算值在定量范圍內，則可能存在鉤狀效應（圖6）。
研究前的驗證過程通常會覆蓋研究樣本的全部稀釋范圍。當研究樣本需要稀釋的濃度超過研究前評估的濃度時，應重復稀釋線性度研究，以涵蓋該濃度。另一種方法是可以包括一個稀釋QC樣品，以確認稀釋后可以準確地測定其濃度。
平行性是分析方法的一個性能特征，通常在研究中驗證期間進行評估。它在概念上類似于稀釋線性，但使用實際研究樣本或研究中產生的代表相同基質和待測物（待測物）組合樣本時，可對多次稀釋進行評估。
通常不會在方法開發的過程中評估平行性，而是將稀釋線性度用作平行性第一階段的評估。
在臨床前研究中驗證分析方法時，有時可以從暴露于高劑量待測物的動物試點研究中獲得樣本。這種類型的樣本可以在研究前驗證中評估平行性。此外，當驗證一個分析方法替代另一個方法時，并且能獲得含有相同藥物（藥物活性成分）的研究樣本時，也可以在研究前驗證期間評估平行性。
可以使用一個研究中的血藥峰濃度（Cmax）樣本來評估平行性，常用的方法之一是將幾個Cmax樣本混合，以生成一個平行性驗證樣品。評估混合樣本的平行性可以避免使用單個研究樣本而產生的多個數值。可以接受的不平行性取決于分析方法的預期應用。作為一個目標，建議稀釋的系列樣品之間的相對標準偏差（%CV）≤30%，同時對樣品稀釋結果非線性（即非平行性）情況預先設定報告結果的程序。
穩健性/耐用性的關鍵是解決在標準實驗室條件下和在實際生活變化的情況下該分析方法是否有效的問題。雖然對于如何確定穩健性和耐用性之間的絕對差異可能存在相當大的爭議，但這兩個參數都是在不同條件下該分析方法重現性的指標。而它們被分開描述，只是為了更清晰地定義，如何在分析開發和驗證生命周期的不同階段對其進行評估。
方法的穩健性取決于在實施了可能影響分析方法的變化時，其效能（performance）的一致性（consistency）。因此，必須重視、測試和記錄這些變化。對一個分析方法有影響的變化必須在方法程序或方法SOP中明確記載，可能影響免疫分析方法的一致性的因素包括：孵育溫度、光暴露(ELISA)和基質的選擇(血漿、血清、腦脊液)。
一個分析方法的耐用性（ruggedness）是在實施日常變化而導致不同操作條件的情況下該方法的一致性。分析人員的變化、不同儀器的使用、運行的大小（batch/run size）、日期、時間或其他環境因素的變化對分析方法一致性或耐用性的影響較小。
在方法開發期間, 評估的運行變量包括但不限于：孵育時間（分析方法的所有步驟）、孵育溫度（所有步驟）、不同的分析人員和用來進行分析的儀器（移液器、移液工作站、清洗儀、讀板機等）。在研究前驗證中，有可能重新評估這些變量的一部分，但重要的是確保在分析方法最終確定之前對它們進行評估，以便設置這些參數的限制范圍，并進行方法驗證。
在研究前評估方法的穩健性和耐用性時，應嘗試評估在研究階段可能影響分析方法的執行和效能的各種條件。
在研究結束時，對QC持續監測的結果以及對運行內/運行間的精密度的評估，可以提供在不同條件下該分析方法的穩健性和耐用性的信息。例如，應允許孵育時間有15%的變化（2h ± 15 min），以適應在常規樣本分析時此類情況發生的狀況。
方法驗證一般可以分為三大類:全面驗證、部分驗證和交叉驗證。對本文所述的任何新方法都要進行全面驗證，這個過程涉及方法開發、研究前驗證和研究中驗證。在動物物種（例如從大鼠到小鼠）和物種內的基質發生變化（例如從大鼠血清到大鼠尿液）時，需要對分析方法進行全面驗證。
當方法變更較小時，可以進行部分驗證；這其中包括方法轉移、抗凝劑的改變（如EDTA、肝素鈉、檸檬酸）、方法的變化（特別是關鍵試劑如主要抗體或次要抗體）、樣品處理過程的變化（如，血液離心轉速，收集容器，儲存條件）、樣品體積、濃度范圍的增加、選擇性問題（同時用藥）、分析人員資格的認證等。部分驗證的范圍可以很寬，從運行內準確度和精密度的單一評估，到近乎全面驗證。更改試劑批次或樣品處理方法可能只需要一次運行。相比之下，分析方法轉移可能需要大量的實驗。
方法轉移是在一個實驗室（方法發出實驗室sending laboratory）建立一個分析方法并轉移到另一個實驗室（方法接收實驗室receiving laboratory），并且至少需要部分驗證的情況。
除了所需的記錄文件（例如方法描述、驗證報告、分析證書/certificate of analysis）外，方法發出實驗室還應提供影響耐用性因素的相關信息（例如，關鍵試劑和物料）。需要制定計劃或方案來確定方法轉移流程（例如，要進行的實驗）和接受標準。
一旦方法轉移通過驗證，一個理想的做法是讓方法發出實驗室和接收實驗室分析30個覆蓋標準曲線范圍的加標盲樣以及30個混合的、用于已測樣品再分析的樣品，并使用統計等效測試對兩組數據進行比較。或亦可以使用商定的可接受范圍比較兩組數據之間的差異。
當在同一研究或申報材料中的數據是通過兩種驗證過的生物分析方法得到時，需要進行交叉驗證。例如兩種驗證過的生物分析方法是ELISA和BiaCore，或者是ELISA和液相色譜/質譜，建議使用測試樣品（test sample，加標樣品和/或混合的已測樣本再分析樣品）進行交叉驗證。
在方法開發過程中，不應設定明確的運行接受標準。對標準曲線性能的早期評估可用于判斷所選試劑和分析格式的適用性。
研究前驗證中，應根據標準曲線的接受標準而決定是否接受一個驗證運行。對研究前驗證樣本則不設接受標準。例如，在準確度和精密度評估期間，不能因為驗證樣本的性能不佳而拒絕一個分析運行；需要報告所有來自研究前驗證運行的數據。在某些情況下，在計算累積平均值之前，可能會有因為可以確定的原因（例如，技術問題）而剔除某些驗證樣本的數據點；但這應該在整個驗證研究結束時進行，并且必須按照文檔記錄的要求記錄。
對于每個研究中驗證運行，標準曲線必須滿足相關接受標準。對于大分子LBA方法，所建議的運行接受標準（見有關準確度和精密度的章節）要求：至少6個QC結果中有4個（67%）必須在其標稱值的30%以內，每個QC濃度級別至少有50%的數值滿足30%的限度。本文所推薦的4-6-30規則同時對所允許的隨機錯誤（不精確度imprecision）和系統誤差（平均偏差mean bias）實施了限制。如果一個分析方法要求QC最終接受標準不同于30%的標稱值偏差，則應調整對于精密度和準確度的研究前驗證的接受標準，使運行間不精確度和絕對平均值RE之和的限度值等于修改后的QC的接受限度值。
LBA分析方法的主要用途是支持生物藥在各個研發階段的藥代動力學研究。如果早期充分地定義LBA定量分析方法的每個組成部分，就應當能夠生成簡潔的驗證計劃和簡單明了的驗證過程。
如本文所述，一個典型的方法驗證包括至少6次精密度和準確度的分析，以證明方法效能的一致性（consistency）。在這些分析運行中，可以確定其它一些參數，包括早期的穩定性、特異性、選擇性和定量范圍。標準曲線需要至少含有6個非零點的濃度，并需要評估其準確度和精密度。除了真實的記錄在案的分析人員的錯誤外，不應該剔除任何分析運行及其數據。驗證樣本定義了該方法的定量范圍，低于LLOQ或高于ULOQ的數值無需報告。在6次驗證試驗中，驗證樣本用來確定多次運行的累積精密度和準確度。在驗證期間，不應該剔除任何驗證樣本，以展示該方法的真實效能。
在樣本分析過程中，方法驗證的生命周期仍在繼續。在接受QC樣品的分析結果之前，首先根據預設的接受標準，確定標準曲線是否通過。只有當標準曲線通過后，才可以評估QC樣品是否可接受；之后，再根據QC的定量結果確定該分析運行是否有效。QC的接受標準可基于4-6-×規則或總誤差，并且可以基于方法開發和研究前驗證階段所使用的標準來預測。總而言之，LBA定量分析方法是一種高靈敏度的定量方法（常規可取得pg/mL級的靈敏度），可用于生物基質中的蛋白質和多肽生物藥的定量分析。
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