上周，“袁來如此”專欄就PK LBA三個(gè)級(jí)別的方法驗(yàn)證策略展開了詳細(xì)介紹（袁來如此｜大分子生物分析概論（三_上）：LBA定量方法驗(yàn)證的策略），圍繞每個(gè)級(jí)別的驗(yàn)證中應(yīng)評(píng)估的參數(shù)、相應(yīng)的接受標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分享，本期將延續(xù)上期內(nèi)容，繼續(xù)分享后續(xù)相關(guān)內(nèi)容。
文檔記錄是所有方法效能評(píng)估工作流程可重構(gòu)性的一個(gè)重要組成部分。
對(duì)于監(jiān)管級(jí)驗(yàn)證的方法，完整和及時(shí)的文檔記錄是建立方法有效性的必要條件。作為文檔記錄的核心內(nèi)容，標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOPs)將規(guī)定監(jiān)管級(jí)驗(yàn)證，包括需要評(píng)估的方法參數(shù)、每個(gè)參數(shù)的接受標(biāo)準(zhǔn)以及特定于某個(gè)方法的驗(yàn)證方案。編寫某個(gè)具體方法的SOP時(shí)，應(yīng)便于該監(jiān)管級(jí)驗(yàn)證后的方法在研究中樣本分析的應(yīng)用，并且還需在每個(gè)研究階段結(jié)束時(shí)提交正式的分析結(jié)果報(bào)告。
對(duì)于科學(xué)級(jí)驗(yàn)證的方法，其相關(guān)文檔記錄與監(jiān)管級(jí)驗(yàn)證相比可以縮減，但必須確保在研究前驗(yàn)證和研究中樣本分析階段生成的數(shù)據(jù)的完整性和有效性。在每個(gè)階段完成之后，操作者在報(bào)告或總結(jié)性文件中應(yīng)當(dāng)記錄每項(xiàng)評(píng)估的結(jié)果。
對(duì)于研究級(jí)驗(yàn)證的工作流程，其相關(guān)文檔記錄與監(jiān)管級(jí)和科學(xué)級(jí)驗(yàn)證相比可以進(jìn)一步縮減，原因是使用研究級(jí)驗(yàn)證的方法其生命周期較短，進(jìn)行簡潔的文檔記錄即可。
監(jiān)管級(jí)：對(duì)于每個(gè)監(jiān)管級(jí)驗(yàn)證，其相關(guān)SOP應(yīng)當(dāng)詳細(xì)介紹必須評(píng)估的方法參數(shù)、如何執(zhí)行每個(gè)參數(shù)的評(píng)估、每個(gè)參數(shù)的接受標(biāo)準(zhǔn)以及適當(dāng)?shù)尿?yàn)證文檔。此外，還應(yīng)為每個(gè)方法準(zhǔn)備一份正式的驗(yàn)證方案，提供與方法實(shí)施相關(guān)的具體信息，包括分析程序的描述說明、關(guān)鍵試劑和非關(guān)鍵試劑的列表、支持該研究的科學(xué)家的列表、驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)操作程序的計(jì)劃偏差以及計(jì)劃偏差的理由。所有文檔都必須存放在安全的環(huán)境中。
科學(xué)級(jí)：應(yīng)撰寫一份實(shí)施研究前驗(yàn)證的計(jì)劃，預(yù)先記錄待評(píng)估的參數(shù)及其接受標(biāo)準(zhǔn)，且需要對(duì)每個(gè)不同的方法所定義的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行評(píng)估，以確保恰當(dāng)?shù)貙?shí)施研究前方法驗(yàn)證。有時(shí)可能需要更寬泛的接受標(biāo)準(zhǔn)，可根據(jù)以下幾方面考慮：（1）項(xiàng)目的具體需要；（2）對(duì)方法開發(fā)過程中積累的數(shù)據(jù)進(jìn)行科學(xué)評(píng)估；（3）如何利用研究中樣本分析數(shù)據(jù)。若相關(guān)參數(shù)和接受標(biāo)準(zhǔn)是在驗(yàn)證之前作出，且在計(jì)劃中提供了理論依據(jù)和評(píng)估時(shí)，則也是可以接受的。或者可以撰寫一個(gè)專門描述需要評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)和科學(xué)級(jí)驗(yàn)證接受標(biāo)準(zhǔn)的SOP作為上述驗(yàn)證計(jì)劃的替代或補(bǔ)充。如果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與SOP中定義的標(biāo)準(zhǔn)不完全一致時(shí)，那么在執(zhí)行支持科學(xué)級(jí)驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)之前，操作員應(yīng)在驗(yàn)證計(jì)劃中記錄該偏差和出現(xiàn)計(jì)劃偏差（planned deviation）的原因。
研究級(jí)：不需要正式的SOP或方案來執(zhí)行研究前驗(yàn)證，但是建議預(yù)先確定好要評(píng)估的方法參數(shù)和接受標(biāo)準(zhǔn)，并記錄下來（在執(zhí)行的每個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的范圍內(nèi)）。
監(jiān)管級(jí)：對(duì)于監(jiān)管級(jí)驗(yàn)證，在完成研究前驗(yàn)證和驗(yàn)證數(shù)據(jù)分析后，需提交正式報(bào)告，此驗(yàn)證報(bào)告應(yīng)包括執(zhí)行該分析方法的逐步說明，所有相關(guān)驗(yàn)證數(shù)據(jù)存儲(chǔ)位置的列表以及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中方法效能的評(píng)估。
在研究中樣本分析開始之前，須有一份詳細(xì)的SOP，概述如何使用該方法來確定未知測試樣品的濃度。此外，還須在SOP中約定闡明允許對(duì)研究樣本進(jìn)行重復(fù)分析的標(biāo)準(zhǔn)、如何確定最終報(bào)告的結(jié)果以及有關(guān)重復(fù)分析的文檔記錄。
在研究中樣本分析階段結(jié)束時(shí)，分析人員須撰寫正式的生物分析報(bào)告詳細(xì)說明該方法的逐步執(zhí)行過程、提供用于分析的生物藥原液（drug stock）的信息、概述STD和QCs的效能、記錄失敗的分析運(yùn)行和樣本的列表、記錄重新分析的樣本以及記錄對(duì)于驗(yàn)證過的方法或方法SOP的偏離。
研究前監(jiān)管級(jí)方法驗(yàn)證的數(shù)據(jù)和研究中真實(shí)樣本生物分析的數(shù)據(jù)的存檔應(yīng)不晚于研究報(bào)告和生物分析報(bào)告定稿的時(shí)間。
科學(xué)級(jí)：對(duì)于科學(xué)級(jí)驗(yàn)證，建議在完成研究前驗(yàn)證和驗(yàn)證數(shù)據(jù)分析后提交報(bào)告或總結(jié)文檔。該科學(xué)級(jí)驗(yàn)證報(bào)告或總結(jié)文檔應(yīng)包括方法的逐步執(zhí)行步驟、所有相關(guān)數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)位置、驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中方法的效能、研究中樣本分析已確認(rèn)的接受標(biāo)準(zhǔn)以及研究中樣本分析計(jì)劃（如適用，包括樣本稀釋方案、特定的分析程序、測試樣本驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)和允許樣本重復(fù)分析的原因）。如果上述所有內(nèi)容都簡明扼要地在總結(jié)文檔中列出，則無需再進(jìn)行正式生物分析的方法SOP。
在研究中未知樣本分析的總結(jié)文件中，應(yīng)參考科學(xué)級(jí)驗(yàn)證的總結(jié)文檔。分析人員可提交一份研究報(bào)告，以記錄研究中樣本分析的執(zhí)行情況。此外，分析人員應(yīng)發(fā)布一份生物分析報(bào)告，用于記錄該方法的效能、所有失敗的微孔板、微孔板/樣本失敗的原因以及樣本分析過程中發(fā)生的偏差。
研究前科學(xué)級(jí)方法驗(yàn)證的數(shù)據(jù)和研究中樣本分析的數(shù)據(jù)存檔，應(yīng)不晚于研究報(bào)告和生物分析報(bào)告的定稿時(shí)間。
研究級(jí)：對(duì)于研究級(jí)驗(yàn)證方法，則不需要在研究前驗(yàn)證執(zhí)行后提交正式報(bào)告，但應(yīng)提供研究前方法效能評(píng)估的簡明文檔，包括方法的執(zhí)行步驟、相關(guān)的數(shù)據(jù)位置以及研究中樣本分析確定的接受標(biāo)準(zhǔn)。
總而言之，不建議為樣本分析制定正式的SOP，也不需要撰寫正式的研究報(bào)告，但分析結(jié)果應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室記錄本或其他適用的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)庫中清楚地匯總說明。
對(duì)于PK定量分析方法的驗(yàn)證，即研究前和研究中方法的效能評(píng)估，采用上述三級(jí)式方法（第1級(jí)-監(jiān)管級(jí)驗(yàn)證;第2級(jí)-科學(xué)級(jí)驗(yàn)證;第3級(jí)-研究級(jí)驗(yàn)證）不僅有利于生物分析業(yè)界，而且能通過實(shí)現(xiàn)更高效、更具成本效益的生物藥開發(fā)來使患者受益。
分析人員選擇適當(dāng)?shù)姆椒ū碚?驗(yàn)證級(jí)別，有助于戰(zhàn)略性地合理使用有限的資源，確保支持新藥發(fā)現(xiàn)或早期開發(fā)階段的研究得到有效執(zhí)行，具有一定的科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)性。
同時(shí)，還能高效產(chǎn)生關(guān)鍵決策所需的PK表征數(shù)據(jù)。當(dāng)前制藥行業(yè)對(duì)不斷提高效率的要求正支持使用這種分級(jí)方式進(jìn)行分析方法的效能評(píng)估。支持候選藥物的選擇或其它單次使用的方法的監(jiān)管級(jí)驗(yàn)證表明，冗長的方法開發(fā)和驗(yàn)證與方法的使用頻率或數(shù)據(jù)的預(yù)期應(yīng)用并不匹配。
用于關(guān)鍵內(nèi)部決策的數(shù)據(jù)存在內(nèi)部時(shí)間敏感性，這也支持PK LBA方法驗(yàn)證的分級(jí)式方法。因?yàn)殚_發(fā)和監(jiān)管驗(yàn)證（根據(jù)監(jiān)管指南）這樣的LBA方法，對(duì)項(xiàng)目進(jìn)展來說實(shí)際上是昂貴的時(shí)間和金錢成本，甚至還延遲了患者獲得新藥的時(shí)間。
生物基質(zhì)、測試試劑和藥物的可及性也限制了早期藥物的開發(fā)。越來越多的研究涉及稀有生物基質(zhì)的使用，而其可及性則限制了LBA方法的開發(fā)和驗(yàn)證。此外，在藥物開發(fā)計(jì)劃的每個(gè)階段，是否能得到合適的試劑會(huì)限制方法效能評(píng)估的范圍，因?yàn)樵谒幬锇l(fā)現(xiàn)階段（新分子實(shí)體出現(xiàn)之前）通常沒有特異性試劑抗體（例如anti-idiotypic antibodies）。然而，即使存在這些限制，仍然需要通過可靠、科學(xué)合理的分析方法來產(chǎn)生準(zhǔn)確的PK結(jié)果，以便做出明智的決策。
在水晶城第五次會(huì)議上，F(xiàn)DA的代表澄清說，針對(duì)非關(guān)鍵決策或內(nèi)部決策進(jìn)行的研究將不受指南的約束，行業(yè)可以采取更加積極的方法平衡科學(xué)需求和監(jiān)管要求，同時(shí)確保得到的數(shù)據(jù)有助于有效的決策。這種觀點(diǎn)已經(jīng)被小分子生物分析專家們所接受，他們已經(jīng)開始討論并建議在PK評(píng)估中使用BMV分級(jí)驗(yàn)證方法。小分子BMV和生物標(biāo)志物評(píng)估倡導(dǎo)基于數(shù)據(jù)的用途來定制生物分析方法的開發(fā)和驗(yàn)證，這獲得了一些監(jiān)管部門專家的支持。然而，大分子生物分析在分析平臺(tái)、基本方法論和大分子藥物的生化/生物物理特性等方面與小分子生物分析存在本質(zhì)上的不同，需要進(jìn)行獨(dú)立考察。
對(duì)于大分子生物藥，LBA測試格式（以免疫測定的形式）是評(píng)估其PK特性的首選分析技術(shù)。定量分析生物基質(zhì)中的大分子濃度存在許多復(fù)雜性，必須考慮它們與內(nèi)源基質(zhì)成分的相互作用和測試格式對(duì)定量的影響。生物藥抗體的存在以及藥物與靶點(diǎn)的相互作用，可能會(huì)給大分子藥物的檢測和精確定量帶來問題。由于LBA方法有限的準(zhǔn)確度和精密度以及使用非線性曲線擬合的必要性，使得大分子LBA方法無法采用與小分子LC-MS方法驗(yàn)證相同的接受標(biāo)準(zhǔn)。
此外，在整個(gè)藥物開發(fā)過程中，對(duì)大分子藥物的表達(dá)系統(tǒng)或緩沖液配方所做的更改可能會(huì)改變藥物的結(jié)合作用和PK特性，因而不可能使用在前一個(gè)水平上經(jīng)過迭代而構(gòu)建的小分子分級(jí)式驗(yàn)證方式。由于這些差異，大分子生物分析方法性能的評(píng)估對(duì)于應(yīng)用迭代的過程是有挑戰(zhàn)的。
在生物藥開發(fā)的整個(gè)生命周期中，可以使用不同級(jí)別的方法驗(yàn)證。應(yīng)當(dāng)指出，每一個(gè)級(jí)別都應(yīng)被視為完全獨(dú)立的方法評(píng)估。即使方法的試劑和測定步驟在研究級(jí)驗(yàn)證和監(jiān)管級(jí)驗(yàn)證之間沒有變化，也應(yīng)分別在每個(gè)級(jí)別進(jìn)行相應(yīng)的方法驗(yàn)證。評(píng)價(jià)方法的效能是否可接受的嚴(yán)謹(jǐn)性也隨著驗(yàn)證級(jí)別的增加而增加。如果有必要，應(yīng)當(dāng)重新開發(fā)和驗(yàn)證一個(gè)方法，以確保它符合必要的接受標(biāo)準(zhǔn)。但這并不是說，在不太嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募?jí)別使用該方法獲得的經(jīng)驗(yàn)不能應(yīng)用于更嚴(yán)謹(jǐn)級(jí)別的方法開發(fā)上，而是不應(yīng)簡單地將附加參數(shù)添加到較低級(jí)別的評(píng)估中，因?yàn)槠詈?CV的接受標(biāo)準(zhǔn)可能更嚴(yán)格，對(duì)相關(guān)文檔記錄和期望的流程可重構(gòu)性的要求也會(huì)增加。
對(duì)大分子方法效能的評(píng)估，即驗(yàn)證級(jí)別的選擇，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)是一個(gè)通過基于可接受風(fēng)險(xiǎn)水平的決策。這些風(fēng)險(xiǎn)水平針對(duì)每種情況，例如在藥物分子、分析方法、生物基質(zhì)和物種水平上的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行特別的評(píng)估。最近，F(xiàn)DA在其指南草案中暗示分析人員使用更靈活的驗(yàn)證工作流程，指出：“對(duì)于需要監(jiān)管機(jī)構(gòu)的行動(dòng)才能獲得批準(zhǔn)的，或者與藥物標(biāo)簽（labeling）相關(guān)的關(guān)鍵研究，如生物等效性（BE）或PK研究，應(yīng)完整地驗(yàn)證生物分析方法。對(duì)用于制藥廠商內(nèi)部決策的探索性方法，較少的驗(yàn)證可能就足夠了”。在指南草案中，F(xiàn)DA還進(jìn)一步澄清說，“本指南也適用于非臨床藥理學(xué)/毒理學(xué)研究的生物分析方法”。適當(dāng)?shù)姆治龇椒ū碚骱万?yàn)證級(jí)別對(duì)于數(shù)據(jù)的預(yù)期用途應(yīng)該科學(xué)合理，如果對(duì)選定適當(dāng)?shù)募?jí)別有任何疑問，則默認(rèn)應(yīng)該進(jìn)行更嚴(yán)格的評(píng)估，或者最終進(jìn)行監(jiān)管級(jí)驗(yàn)證。
對(duì)于向監(jiān)管部門提交的申報(bào)文件中的數(shù)據(jù)，如果數(shù)據(jù)可能對(duì)患者安全產(chǎn)生很大影響，或者這些數(shù)據(jù)是用于證明療效（例如GLP非臨床藥理學(xué)/毒理學(xué)研究、支持劑量選擇或標(biāo)簽聲明的研究、在疾病適應(yīng)癥人群進(jìn)行的臨床I期研究），則需要對(duì)相關(guān)分析方法進(jìn)行監(jiān)管級(jí)驗(yàn)證（第1級(jí)，Tier 1）。對(duì)于非關(guān)鍵性研究（例如非GLP、在健康志愿者中進(jìn)行的臨床I期研究，如單次上升劑量（SAD）或多次上升劑量（MAD）研究時(shí)，當(dāng)PK不是研究的主要或次要終點(diǎn)時(shí)、概念驗(yàn)證研究時(shí)），可以應(yīng)用科學(xué)級(jí)驗(yàn)證（第2級(jí)，Tier 2）。
此外，當(dāng)PK將作為GLP非臨床或臨床研究的一部分，在稀有的生物基質(zhì)（例如，精液、關(guān)節(jié)腔滑液、誘導(dǎo)痰、口腔內(nèi)拭紙、組織均質(zhì)、支氣管肺泡灌洗[BAL]液、尿液等）中進(jìn)行評(píng)估時(shí)，可以使用科學(xué)級(jí)驗(yàn)證的分析方法（第2級(jí)，Tier 2），如FDA指南草案中說明的，本指南可能適用于血液和尿液的BA、BE和PK研究。對(duì)于用于內(nèi)部決策（例如探索性研究、候選藥物的選擇、配方比較或?qū)λ幚頇C(jī)制的研究）或作為非GLP 或藥物發(fā)現(xiàn)研究中使用了稀有基質(zhì)的PK評(píng)估，可以應(yīng)用研究級(jí)驗(yàn)證工作流（第3級(jí)，Tier 3）。圖1概述了在藥物開發(fā)的各個(gè)階段，可以應(yīng)用于各個(gè)階段的相應(yīng)級(jí)別的方法驗(yàn)證流程。
應(yīng)該在方法開發(fā)階段開始之前決定對(duì)該方法進(jìn)行哪一級(jí)的驗(yàn)證，并基于上述優(yōu)先標(biāo)準(zhǔn)作出決定，有助于開發(fā)符合其用途的方法，并防止“過度開發(fā)”僅需要研究級(jí)驗(yàn)證的方法，或防止重新開發(fā)一個(gè)需要監(jiān)管級(jí)驗(yàn)證的方法來使其更加穩(wěn)健或有更少的干擾，因?yàn)檫@兩種情況都將可能耗費(fèi)更多的資源和時(shí)間。如果對(duì)如何使用給定方法生成的數(shù)據(jù)有疑問，或者對(duì)某個(gè)藥物開發(fā)項(xiàng)目進(jìn)行不太嚴(yán)格的分析方法驗(yàn)證存在固有風(fēng)險(xiǎn)，則最好默認(rèn)為選擇更嚴(yán)格的驗(yàn)證級(jí)別。圖2提供了一個(gè)示例決策樹，以幫助選擇適當(dāng)?shù)尿?yàn)證級(jí)別。
本文提出的分級(jí)方法驗(yàn)證模式，通過對(duì)分析方法進(jìn)行不同級(jí)別的驗(yàn)證，目的是在已確立的監(jiān)管指南范圍之外，提供適合其目標(biāo)生物分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量保證。本文為實(shí)施這種分級(jí)方式提供了一個(gè)切實(shí)可行的理論框架，并提出了預(yù)先選擇適當(dāng)驗(yàn)證級(jí)別的理由。這種方式基于合理的科學(xué)原理，并且在每一個(gè)項(xiàng)目上對(duì)不同級(jí)別的驗(yàn)證所伴隨的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行獨(dú)立的評(píng)估。建議各新藥開發(fā)商針對(duì)各自獨(dú)特的藥物開發(fā)項(xiàng)目和情況，對(duì)分析方法效能的驗(yàn)證級(jí)別作出合理選擇。
筆者認(rèn)為可以初步劃分監(jiān)管級(jí)、科學(xué)級(jí)和研究級(jí)驗(yàn)證的適用范圍如下（供討論，與上文中一些建議和圖表并不完全一致）。另外不同的藥物開發(fā)商可以采用類似但并非完全一致的策略，特別是在科學(xué)級(jí)驗(yàn)證和研究級(jí)驗(yàn)證上：
1. 監(jiān)管級(jí)驗(yàn)證：所有研究結(jié)果和數(shù)據(jù)必須納入向監(jiān)管機(jī)構(gòu)提供的申報(bào)/注冊(cè)文件，包括非臨床GLP安全性研究、臨床I期PK/PD研究、人體生物等效性研究、臨床II/III期的關(guān)鍵PK或PD研究、藥物標(biāo)簽（labeling）相關(guān)的研究等。
2. 科學(xué)級(jí)驗(yàn)證：研究結(jié)果和數(shù)據(jù)一般不會(huì)納入向監(jiān)管機(jī)構(gòu)提供的文件中，除非監(jiān)管機(jī)構(gòu)有特別要求，有臨床前non-GLP試點(diǎn)PK/PD研究（non-GLP pilot PK/PD/Tox studies in Tox animal species）、動(dòng)物生物利用度研究、其它非關(guān)鍵性研究如制劑優(yōu)化和候選藥物的選擇等。
3. 研究級(jí)驗(yàn)證：研究結(jié)果和數(shù)據(jù)僅供藥物開發(fā)商內(nèi)部使用，如首次動(dòng)物PK/PD研究、候選藥物的選擇等。
4. 特別聲明
本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請(qǐng)讀者評(píng)論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經(jīng)發(fā)表的學(xué)術(shù)期刊、官方網(wǎng)絡(luò)報(bào)道等公開渠道, 不涉及任何保密信息。參考文獻(xiàn)的選擇考慮到多樣化但也不可能完備，歡迎讀者提供有價(jià)值的文獻(xiàn)及其評(píng)估。
