上周，“袁來(lái)如此”專欄就大分子生物分析方法的校準(zhǔn)曲線的設(shè)計(jì)、生成和編輯的思考和建議展開(kāi)了詳細(xì)介紹（袁來(lái)如此｜大分子生物分析概論（四_上）：校準(zhǔn)曲線的設(shè)計(jì)，生成和編輯），本期將延續(xù)上期內(nèi)容，重點(diǎn)介紹大分子生物分析方法校準(zhǔn)曲線擬合模型和權(quán)重進(jìn)行取舍的方法。
本系列文章介紹的生物分析是指定量地測(cè)定在動(dòng)物和人體體液或組織中的生物藥（本文特指蛋白質(zhì)類生物藥，包括單抗，細(xì)胞因子，生長(zhǎng)素，融合蛋白等）的濃度。大多數(shù)生物分析方法都基于免疫測(cè)試方法（Immunoassays），或者更廣義地稱為，配體結(jié)合式測(cè)試方法（ligand binding assays, LBA）。這些方法涉及一系列試劑的使用，如抗藥物抗體，其它抗體，生物藥的靶標(biāo)蛋白等。
配體結(jié)合式測(cè)試方法（LBA，也稱為immunoassays）是一種常用的定量分析工具。在LBA方法中，待測(cè)物濃度與響應(yīng)數(shù)據(jù)之間的關(guān)系是質(zhì)量作用定律驅(qū)動(dòng)的非線性關(guān)系，兩個(gè)被廣泛接受和經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的LBA校準(zhǔn)曲線的回歸模型是4參數(shù)logistic（4PL）和5參數(shù)logistic（5PL）曲線擬合模型。選擇適當(dāng)?shù)幕貧w模型和權(quán)重函數(shù)是LBA方法開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵組成部分。
在分析方法開(kāi)發(fā)期間，應(yīng)對(duì)選定的模型和權(quán)重函數(shù)進(jìn)行評(píng)估，并在驗(yàn)證期間加以確認(rèn)。關(guān)于確定或選擇適當(dāng)?shù)幕貧w模型和權(quán)重函數(shù)的實(shí)際操作方法，在已發(fā)表的文獻(xiàn)中頗為有限，本文將提出一個(gè)結(jié)構(gòu)化的、有序的方案來(lái)確定兩者。
在LBA中觀察到的實(shí)驗(yàn)響應(yīng)是一個(gè)配體（待測(cè)物）和檢測(cè)系統(tǒng)中使用的特定捕獲/檢測(cè)試劑的平衡結(jié)合的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)響應(yīng)與對(duì)數(shù)變換后濃度之間的這種關(guān)系是非線性的，使得典型的LBA校準(zhǔn)曲線為全部或部分的S型（sigmoidal）。常見(jiàn)的非線性回歸模型為4PL和5PL，擬合模型的選擇可能由曲線的形狀所驅(qū)動(dòng)。完全的 sigmoidal曲線（其中頂部和底部平臺(tái)區(qū)是鏡像）通常使用4PL 模型。部分sigmoidal曲線，即非對(duì)稱曲線，通常使用5PL模型（4PL、5PL模型詳細(xì)解讀請(qǐng)戳《袁來(lái)如此｜大分子生物分析概論（四_上）：校準(zhǔn)曲線的設(shè)計(jì)，生成和編輯》）。
由于LBA中配體平衡結(jié)合（equilibrium binding）的特性，經(jīng)常會(huì)觀察到測(cè)試響應(yīng)的非恒定的方差（non-constant variance of response），這種不等同方差稱為異方差性（heteroscedasticity）。如果在曲線擬合時(shí)不考慮應(yīng)對(duì)異方差性，則可能導(dǎo)致最終結(jié)果中出現(xiàn)回算錯(cuò)誤和更大的偏差。為了減少異方差性的影響并提高曲線擬合的質(zhì)量，必須盡量減少具有較高方差（higher variance）的校準(zhǔn)點(diǎn)對(duì)曲線擬合的貢獻(xiàn)，廣義最小平方 （generalized least squares）和方差穩(wěn)定變換（variance stabilizing transformation）可以用來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。這些方法要么在每個(gè)擬合迭代后更新權(quán)重函數(shù)；要么轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)和模型，以使用普通最小平方模型，而不使用權(quán)重函數(shù)。在已發(fā)表的方法中，線性回歸斜率方法（linear regression slope approach）可能是最實(shí)用的。本文下面討論這個(gè)方法。
大多數(shù)與 LBA測(cè)試相關(guān)的軟件為各種擬合模型和常用的權(quán)重函數(shù)（如 1/Y 或 1/Y2）提供了內(nèi)置的選擇。相關(guān)監(jiān)管指南建議使用最簡(jiǎn)單，并充分描述了待測(cè)物濃度與其響應(yīng)之間關(guān)系的模型。在選擇回歸模型（加或不加權(quán)重）時(shí)，如果對(duì)曲線形狀的目視評(píng)估和對(duì)使用的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行比較，如比較F測(cè)試和chi-square p value，并不容易，其結(jié)果可能會(huì)令人困惑。這里常見(jiàn)的挑戰(zhàn)是如何依據(jù)相關(guān)知識(shí)，合理地選擇其中之一。
本文將介紹一組案例研究，其中采用藥代動(dòng)力學(xué)定量分析方法，用于血清或血漿中蛋白生物藥的定量，以及使用通用的統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)確定適當(dāng)?shù)臄M合模型和權(quán)重因子。
LBA方法是評(píng)估生物藥的PK/TK時(shí)的主要定量分析方法，該方法的特異性和選擇性取決于目標(biāo)待測(cè)物與其他生物分子（如受體、和針對(duì)候選生物藥的抗體）的相互作用。LBA方法中觀察到的信號(hào)/響應(yīng)與生物藥的濃度間接相關(guān)。
下面的示例A、B和C都使用了LBA方法，如電化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)平臺(tái)或比色法ELISA檢測(cè)平臺(tái)，用于定量分析血漿或血清（人或食蟹猴）中的蛋白生物藥濃度。每個(gè)案例研究中的分析方法簡(jiǎn)述如下：
案例A：對(duì)Meso Scale Discovery（MSD）Multi-Array?微孔板，使用單克隆抗藥物抗體（5 ?g/mL）包板，過(guò)夜；之后，與含有藥物的樣品在室溫下孵育60分鐘；洗板后，結(jié)合到板上的藥物與biotinylated單克隆檢測(cè)抗體（2.5??g/mL）孵育60分鐘；然后加入0.1??g/mL 的Streptavidin-ruthenium，再孵育60分鐘；之后，MSD儀器在特定條件下檢測(cè)到來(lái)自ruthenium 的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。
案例B：對(duì)streptavidin 包被的MSD Multi-Array?微孔板，在室溫下，以biotinylated單克隆抗體（4mg/mL）包板60至120分鐘；隨后，含有藥物的樣品在上述微孔板上孵育90分鐘；使用小鼠抗人IgG Fc-Ruthenium（0.36mg/mL）孵育60分鐘，以結(jié)合被抗體捕獲的生物藥；之后，MSD儀器在特定條件下檢測(cè)到來(lái)自ruthenium 的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。
案例C：在Costar微孔板上，在4°C包被藥物靶點(diǎn)（4 mg/mL），過(guò)夜；與靶點(diǎn)結(jié)合后的生物藥，再與50 ng/mL的biotinylated單克隆抗體孵育60分鐘；之后，再與1:50,000稀釋后的avidin D-HRP 孵育60分鐘；隨后，加入HRP酶底物，TMB，以產(chǎn)生色度反應(yīng)；然后用硫酸停止該反應(yīng)，并在酶標(biāo)儀Spectramax上，測(cè)量450nm的光學(xué)密度（OD）。
異方差性（Heteroscedasticity）
在采集到的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)數(shù)據(jù)集合（standard calibration data）中，可以通過(guò)觀察測(cè)試信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和校準(zhǔn)點(diǎn)濃度之間的關(guān)系來(lái)評(píng)估異方差性。為此，分別評(píng)估了案例A、B和C在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中獲得的6、7和10個(gè)獨(dú)立運(yùn)行。
首先，使用Microsoft Excel 2010計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)方差，其次使用 GraphPad Prizm 7 來(lái)繪制每個(gè)校準(zhǔn)品測(cè)試信號(hào)的SD與校準(zhǔn)點(diǎn)濃度的關(guān)系圖。在目視考查了SD變化的趨勢(shì)后，就可以確定對(duì)權(quán)重函數(shù)的需求。如果SD發(fā)生移動(dòng)，則表明了異方差性，因此，需要使用權(quán)重函數(shù)。如果SD在校準(zhǔn)品濃度范圍內(nèi)是恒定的，則無(wú)需加權(quán)。
當(dāng)在校準(zhǔn)曲線中觀察到測(cè)試信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差隨濃度發(fā)生變化時(shí)，就需要對(duì)更精確的數(shù)據(jù)點(diǎn)（具有較低SD的數(shù)據(jù)）使用權(quán)重函數(shù)來(lái)調(diào)整曲線的擬合。在 GraphPad Prizm 7 中，可以使用圖形線性回歸方法（graphical linear regression approach）計(jì)算權(quán)重函數(shù)因子如下：
步驟1. 繪制下述二者的關(guān)系圖：對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的測(cè)試信號(hào)平均值與對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的SD，對(duì)二者使用相同的對(duì)數(shù)底數(shù)（10或2）。
步驟2. 在步驟1中得到的線性回歸直線的斜率值（k）乘以2，以確定權(quán)重函數(shù)因子（weighting function factor），即2k。
為了平衡所有校準(zhǔn)點(diǎn)的貢獻(xiàn)，在4PL或5PL曲線擬合中應(yīng)用權(quán)重函數(shù) 1/Y2k（其中Y是測(cè)試信號(hào)，2k是權(quán)重因子），以盡量減少weighted sum-of-squares，從而獲得更好的準(zhǔn)確度和精密度。
將權(quán)重函數(shù) 1/Y2k 應(yīng)用于曲線擬合模型 （4PL 或 5PL）后，再使用Watson LIMS，將回算的校準(zhǔn)點(diǎn)濃度插入加權(quán)擬合的曲線（假定這些校準(zhǔn)點(diǎn)是未知濃度的樣本）。
如果對(duì)所有測(cè)試運(yùn)行和對(duì)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)點(diǎn)（錨定點(diǎn)除外），累積%RE在±15% 之內(nèi)并且累積%CV≤15%，則回歸模型是可以接受的；但對(duì)于定量下限（LLOQ）和上限（ULOQ），接受標(biāo)準(zhǔn)一般 %RE±20和累積 %CV≤20。估計(jì)的定量范圍（ROQ）是在符合上述接受標(biāo)準(zhǔn)的最低和最高標(biāo)準(zhǔn)濃度之間確定的。在 MS Excel 2010 中，累計(jì)%RE和累積%CV 分別計(jì)算為：[100 - 100 x（回算濃度的平均值/標(biāo)稱濃度）]和 100 X（回算濃度的標(biāo)準(zhǔn)方差/回算濃度的平均值）。
之后，使用 GraphPad Prizm 7 繪制 4PL 和 5PL 之間準(zhǔn)確度（累積cumulative %RE）和精密度（累積cumulative %CV）的比較圖。回歸模型的適宜性可使用此可視化圖形工具來(lái)判斷：在可接受的范圍內(nèi)包含了更多標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)點(diǎn)，而且累積 %RE 和累積 %CV 較低模型，就是應(yīng)該選擇的模型。如果兩種模型的效能非常相似，則可通過(guò)是否具有加權(quán)4PL來(lái)做選擇 ，因?yàn)橐话阕裱?Occam’s razor 原則， 即以最少的假設(shè)，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)和模型之間的關(guān)系。
圖1. 選擇曲線擬合模型以提高曲線性能的方法。實(shí)際工作流程描述了選擇權(quán)重函數(shù)和曲線擬合模型的每個(gè)步驟和整個(gè)過(guò)程。
本文提出了一種結(jié)構(gòu)化的方法，通過(guò)選擇正確的曲線擬合模型和權(quán)重函數(shù)，以擴(kuò)展 LBA分析方法的定量范圍（圖1）。該方法完全從數(shù)學(xué)的角度出發(fā)，確定一條校準(zhǔn)曲線是否需要加權(quán)重以及哪種加權(quán)方式最合理。如果收集到的數(shù)據(jù)中呈現(xiàn)出的異質(zhì)性，則在準(zhǔn)確度和精密度行為方面，對(duì)4PL和5PL兩個(gè)模型（以及確定的權(quán)重函數(shù)）進(jìn)行比較；如果未觀察到異方差性，則對(duì)不含權(quán)重量4PL和5PL模型進(jìn)行比較。以下將此原則應(yīng)用于3個(gè)典型 LBA分析案例。在這3個(gè)生物藥的藥代動(dòng)力學(xué)（PK）研究案例中，總共開(kāi)發(fā)了3個(gè)分析方法，并觀察到3種不同形狀的校準(zhǔn)曲線。其中，兩個(gè)分析方法（案例A和B）利用了電化學(xué)發(fā)光（ECL）平臺(tái)，而另一個(gè)分析方法（案例C）使用了比色ELISA平臺(tái)。
為了在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中對(duì)濃度-測(cè)試信號(hào)的關(guān)系進(jìn)行詳細(xì)研究，表1中描述了定量分析生物藥A、B和C濃度的3條校準(zhǔn)曲線。在預(yù)期的定量范圍內(nèi)（對(duì)數(shù)尺度上），校準(zhǔn)點(diǎn)大致均勻分布。
表1. 3條PK校準(zhǔn)曲線的特征總結(jié)
用于評(píng)估各自PK分析運(yùn)行的校準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)如圖2所示。在所有3個(gè)案例研究中都觀察到了典型的非線性的濃度-響應(yīng)曲線。
圖2. 3個(gè)案例研究中的校準(zhǔn)曲線：案例 A（a），案例 B（b） 和案例 C（c）。該圖展示了3條標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀，代表了在LBA測(cè)試中通常觀察到的典型非線性響應(yīng)。X軸代表校準(zhǔn)點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)，Y軸代表響應(yīng)讀數(shù)：案例A和B是相對(duì)光單位（RLU），案例C是450 nM 光學(xué)密度（OD 450）。
圖3. 案例A（a）、案例B（b）和案例C（c）的異方差性概況。X軸代表校準(zhǔn)點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)，Y軸代表實(shí)驗(yàn)運(yùn)行中測(cè)試信號(hào)的SD。
下面評(píng)估了表1中3條校準(zhǔn)曲線上測(cè)試信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），該SD是異方差性的直接指標(biāo)。這3條校準(zhǔn)曲線上測(cè)試信號(hào)的SD（變異性variability）不是恒定的，而是隨著校準(zhǔn)點(diǎn)的濃度而改變化的（圖3）。
對(duì)于案例A，當(dāng)藥物濃度超過(guò) 20 ng/mL時(shí)，其變異性急劇增加。在案例B中，SD大幅增加，直到48.3 ng/mL的濃度，并在 48.3和 250 ng/mL 之間出現(xiàn)下降趨勢(shì)。對(duì)于案例C ，SD 增加，一直到23.5 ng/mL的濃度，之后稍微降，直至79.3 ng/mL。總體而言，濃度較高校準(zhǔn)點(diǎn)的SD大于濃度較低校準(zhǔn)點(diǎn)。校準(zhǔn)曲線之間的非恒定 SD 模式代表示異方差性，在較高濃度下的高變異性表明需要使用加權(quán)擬合。圖1所示的決策樹(shù)指明了如何確定適當(dāng)?shù)臋?quán)重因子和可以接受的擬合模型。
為了確定權(quán)重因子，首先需要從下面的線性回歸中得出斜率（k值）：對(duì)數(shù)變換的測(cè)試信號(hào)SD vs 對(duì)數(shù)變的換測(cè)試信號(hào)平均值（圖4）；然后，應(yīng)用 1/Y2k 方程式來(lái)計(jì)算最終的權(quán)重函數(shù)。對(duì)于案例 A，B 和 C，線性回歸的斜率分別為 1.06、1.00 和 0.657。對(duì)于案例 A 和 B，由于斜率接近1.0，因此在4PL和5PL模型中使用了權(quán)重函數(shù)1/Y2 。對(duì)于 C 例，權(quán)重函數(shù)為 1/Y，由于斜率接近 0.5。在Waston LIMS中，只有 1/Y or 1/Y2這兩種權(quán)重函數(shù)可用。
圖4. 案例 A（a）、案例 B （b） 和案例 C （c）中k值的確定。案例 A、B 和 C 的斜率（k值）分別為 1.06、1.00 和 0.657。案例A、B和C的R2（確定系數(shù)coefficient of determination）分別為0.998、0.984和0.934。
為確定可以接受的曲線擬合模型，考察了如下參數(shù)：4PL和 5PL模型；權(quán)重函數(shù)：1/Y2（案例A），1/Y2（案例B）和 1/Y（案例C）；比較參數(shù)：回算濃度的累積 %RE（圖5）和累積 %CV（圖6）。應(yīng)當(dāng)選擇在可接受的范圍內(nèi)，具有較低的%CV和%RE校準(zhǔn)點(diǎn)數(shù)量較多的回歸模型。如果兩者都是相當(dāng)?shù)模瑒t應(yīng)選取加權(quán)4PL作為最終的曲線擬合模型。在 Watson LIMS 中生成每次運(yùn)行的回算濃度。所有情況的回算濃度的累積 %RE和 %CV計(jì)算（在曲線擬合模型確定章節(jié)的 B 部分）。圖5和圖6給出了加權(quán)4PL模型與加權(quán)5PL模型的累積 %RE和累積 %CV的比較。
如圖5所示，對(duì)于具有相應(yīng)權(quán)重函數(shù)的4PL和5PL模型，所有校準(zhǔn)點(diǎn)的 %RE分別：案例A， 低于4%和3%；案例 B，低于18%和16%；案例 C，低于7 和 6%。在所有案例研究中，加權(quán)4PL和加權(quán)5PL模型的準(zhǔn)確度是相當(dāng)?shù)模瑢?duì)于案例 A、B 和 C，所有校準(zhǔn)點(diǎn)都在可以接受的范圍內(nèi)。根據(jù)準(zhǔn)確度行為圖推斷的定量范圍（ROQ）分別為：0.317-178 ng/mL（案例A），0.602-250 ng/mL（案例B），和1.37-79.3 ng/mL（案例C）。
圖5. 準(zhǔn)確度行為圖。對(duì)案例A（a）、案例B（b）和案例C（c）中校準(zhǔn)曲線的加權(quán)（1/Y或者1/Y2）擬合模型進(jìn)行了比較。比較模型：4PL vs 5PL；比較參數(shù)：回算濃度的累積相對(duì)誤差（%RE）。兩條虛線之間的區(qū)域是可接受范圍（± 20%）。（○）代表4PL加權(quán)擬合，（□）代表5PL加權(quán)擬合。
圖6顯示，對(duì)于加權(quán)4PL和加權(quán)5PL曲線擬合模型，所有校準(zhǔn)點(diǎn)的累計(jì)%CV：案例A，低于3.0和2.9%；案例B，低于39.7%和26.3%；案例C，低于6.6%和10.8%。案例A和C對(duì)兩個(gè)擬合模型加權(quán)擬合后，所有校準(zhǔn)點(diǎn)的 %CV變得相當(dāng)了。對(duì)案例A和C，所有校準(zhǔn)點(diǎn)的加權(quán)4PL和加權(quán)5PL的精密度也是相似的。根據(jù)精密度行為圖推斷的ROQ分別為0.317-178 ng/mL（案例A）和1.37-79.3 ng/mL（案例C）。使用加權(quán)4PL模型，與加權(quán)5PL模型相比，案例B可以接受的校準(zhǔn)點(diǎn)數(shù)量從9增加到11，加權(quán)4PL模型的估算的ROQ 為 0.602-145 ng/mL，而加權(quán)5PL模型的檢測(cè)范圍較窄：0.602 - 48.3 ng/mL。根據(jù)接受標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于案例 A、B 和 C ，最終可以接受的曲線擬合模型都是4PL，權(quán)重函數(shù)分別為 1/Y2，1/Y2和1/Y。
圖6. 精密度行為圖：案例A（a），案例B（b）和案例C（c）比較模型：加權(quán)4PL vs 加權(quán)5PL；比較參數(shù)：回算濃度的 %CV。虛線和X軸之間的區(qū)域是可接受范圍（± 20%）。（○）代表 4PL 加權(quán)擬合，（□）代表 5PL 加權(quán)擬合。
圖7演示了對(duì)案例 A 應(yīng)用上述方案后，校準(zhǔn)曲線性能是如何改進(jìn)的（此處不顯示案例B和C的圖表）。使用非加權(quán)4PL回歸模型回算濃度繪制的準(zhǔn)確度行為圖（累積 %RE，圖7a）表明，與加權(quán)相比此模型表現(xiàn)出更窄的動(dòng)態(tài)范圍，0.563-178 ng/mL；加權(quán)4PL模型：0.317-178 ng/mL。非加權(quán) 5PL回歸模型顯示更好的準(zhǔn)確度：所有校準(zhǔn)點(diǎn)低于20%。但是，在應(yīng)用1/Y2的權(quán)重函數(shù)（在“異方差度評(píng)估”章節(jié)確定）后， 所有校準(zhǔn)點(diǎn)的累積 %RE得到改善，都在±3%以內(nèi)（圖7a）。
精密度行為圖（累積 %CV，圖7b）顯示，非加權(quán)4PL和5PL回歸模型的ROQ顯著狹窄：1.00-178 ng/mL；而在使用了1/Y2 的權(quán)重函數(shù)后，ROQ變?yōu)?.317-178 ng/mL。該校準(zhǔn)曲線低端的效能的顯著改善顯示了加權(quán)擬合的力量，因其降低了高變異性的測(cè)試信號(hào)對(duì)曲線擬合的影響。案例A表明，使用適當(dāng)?shù)臋?quán)重函數(shù)可以提高精密度和準(zhǔn)確度（均低于4%）以及擴(kuò)展定量范圍（0.317-178 ng/mL）。
圖7. 案例A標(biāo)準(zhǔn)曲線加權(quán)之前和之后，4PL和5PL模型的準(zhǔn)確度和精密度行為圖。累積 %RE（圖 7a）和累計(jì) %CV（圖7b）在模型之間的比較：4PL vs. 5PL（無(wú)權(quán)重）；以及4PL vs. 5PL（權(quán)重因子：1/Y2）。
表2顯示，使用適當(dāng)?shù)臋?quán)重函數(shù)可以擴(kuò)展ROQ。對(duì)案例B，應(yīng)用權(quán)重函數(shù)到4PL回歸模型后，ROQ得到顯著擴(kuò)展；從未加權(quán)的1.04-48.3 ng/mL到 加權(quán)的0.602-145 ng/mL；加權(quán)5PL模型的ROQ，則從未加權(quán)1.04-145 ng/mL變?yōu)榧訖?quán)的0.602-48.3 ng/mL。對(duì)案例C，4PL模型的ROQ略有擴(kuò)展：從未加權(quán)的2.06-79.3 ng/mL，到加權(quán)的1.37-79.3 ng/mL。對(duì)于5PL模型，使用權(quán)重函數(shù)后ROQ沒(méi)有增加。
本文為確定LBA定量分析方法中校準(zhǔn)曲線的回歸模型及權(quán)重函數(shù)的選擇，提供了一個(gè)決策樹(shù)和相應(yīng)的方法，目的是為了為減少異方差性（heteroscedasticity）的影響。本文的建議得到3個(gè)案例研究的支持。
由于LBA中平衡結(jié)合（equilibrium binding）的特性，實(shí)踐中經(jīng)常觀察到測(cè)試響應(yīng)的非恒定方差，稱為異方差性（heteroscedasticity）。本文發(fā)現(xiàn)線性回歸斜率方法（linear regression slope approach）是解決異方差性最實(shí)際的方法。
在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，可以繪制校準(zhǔn)曲線的測(cè)試信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)方差（standard deviation，SD）與校準(zhǔn)點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)的相關(guān)圖。一條校準(zhǔn)曲線的非恒定SD趨勢(shì)表明存在異方差性，這意味著需要使用權(quán)重函數(shù)。所有的3個(gè)案例研究（A，B 和 C）都顯示，測(cè)試信號(hào)在較高藥物濃度下，具有更高的變異性，需要加權(quán)擬合校準(zhǔn)曲線。一般而言，任何一個(gè)LBA定量分析方法，都會(huì)受益于使用權(quán)重函數(shù)。
需要注意的是，一旦確定需要權(quán)重因子，如何確定正確的權(quán)重因子則成為重中之重。本文推薦的方法是：首先，從測(cè)試信號(hào)（Y）的標(biāo)準(zhǔn)方差（對(duì)數(shù)變換后）與測(cè)試信號(hào)平均值（對(duì)數(shù)變換后）的線性回歸關(guān)系中，確定其斜率，又稱k值；然后，將斜率（k） 代入以下方程 1/Y2k 中，以確定權(quán)重因子（1/Y 或 1/Y2）。
在案例研究 A、B、C 中，線性回歸的斜率分別為 1.06，1.00 和 0.657; 因此，權(quán)重因子分別估計(jì)為2，2和1。在案例A和B中，權(quán)重因子為2; 因此，在校準(zhǔn)曲線回歸模型（4PL或5PL）中，使用了權(quán)重函數(shù)1/Y2。對(duì)于案例C，權(quán)重系數(shù)為 1; 因此，權(quán)重函數(shù)為 1/Y。
為了確定可接受的曲線擬合模型，應(yīng)評(píng)估擬合曲線的4PL與5PL模型（不加權(quán)和加權(quán)）回算濃度的累積 %RE和累積 %CV。應(yīng)當(dāng)選擇，在可接受的范圍內(nèi)，具有較低的%CV和%RE，校準(zhǔn)點(diǎn)數(shù)量較多的回歸模型。如果兩者都是相當(dāng)?shù)模瑒t選擇加權(quán)4PL模型作為最終曲線擬合模型，進(jìn)行方法驗(yàn)證和樣本分析。根據(jù) FDA 指南，應(yīng)當(dāng)選擇假設(shè)最少的模型，即選擇最簡(jiǎn)單的模型。根據(jù)精密度和準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)，在所有3個(gè)案例中，4PL都是基于這些標(biāo)準(zhǔn)的最佳回歸模型。
為了驗(yàn)證所選擇回歸模型和權(quán)重函數(shù)，可以做其他評(píng)估。例如，在使用權(quán)重函數(shù)之前和之后，可以比較4PL和5PL模型的準(zhǔn)確度和精密度行為。本文給出了4PL與5PL（無(wú)加權(quán)和 1/Y2加權(quán)）的累積 %CV 和累積 %RE 的比較，累積 %RE的可接受范圍為± 20%，累積 %CV 的可接受范圍為≤20%。
案例A表明，使用適當(dāng)?shù)臋?quán)重函數(shù)可以提高精密度和準(zhǔn)確性（均低于10%）和擴(kuò)展定量范圍（0.317-178 ng/mL）。在案例B和C中，校準(zhǔn)曲線擬合也有改善。案例B在4PL回歸模型上加權(quán)后，ROQ得到顯著擴(kuò)展：未加權(quán)時(shí)為1.04-48.3 ng/mL；加權(quán)后為 0.602-145 ng/mL；5PL模型，未加權(quán)1.04-145 ng/mL，加權(quán)后0.602-48.3 ng/mL。案例C4PL模型在加權(quán)后ROQ 略有擴(kuò)展：未加權(quán)2.06-79.3 ng/mL；加權(quán)為1.37-79.3 ng/mL。
在定量 LBA 方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，本文介紹了一個(gè)簡(jiǎn)單、易于使用的決策樹(shù)，以確定校準(zhǔn)曲線的最佳回歸模型和權(quán)重。所推薦的方法將選擇一個(gè)加權(quán)的曲線擬合模型。
1. 在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，至少需要使用3個(gè)獨(dú)立的測(cè)試運(yùn)行對(duì)模型選擇進(jìn)行初步評(píng)估; 但是，一般建議增加運(yùn)行的數(shù)量，以便在研究前驗(yàn)證時(shí)，驗(yàn)證曲線擬合模型。由于對(duì)響應(yīng)-誤差關(guān)系的估計(jì)存在局限性，因此不建議使用較小的數(shù)據(jù)集合；
2. 評(píng)估異方差性；
3. 如果存在異方差性，就通過(guò)斜率方法確k值（即斜率），然后計(jì)算權(quán)重因子（權(quán)重函數(shù)=1/Y2k）；
4. 使用準(zhǔn)確度（%RE）和精密度（%CV）行為來(lái)選擇和驗(yàn)證更好的加權(quán)回歸模型；
5. 建議使用獨(dú)立制備的質(zhì)量控制樣品（QC）來(lái)驗(yàn)證分析方法的定量范圍。
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