上周，“袁來(lái)如此”專欄就藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中如何緩解或消除對(duì)LBA定量分析方法干擾的策略展開(kāi)了詳細(xì)介紹(袁來(lái)如此｜大分子生物分析概論（六）上：LBA定量抗體藥物的背景干擾及其消除)，本期將延續(xù)上期內(nèi)容，重點(diǎn)關(guān)注抗體生物藥的定量分析。
“袁來(lái)如此”專欄系廣州博濟(jì)醫(yī)藥微信公眾號(hào)打造的科普學(xué)術(shù)專欄，內(nèi)容均為博濟(jì)醫(yī)藥子公司深圳博瑞副總經(jīng)理袁智博士原創(chuàng)。
LBA測(cè)試方法常用于定量生物基質(zhì)中抗體藥物的濃度，根據(jù)測(cè)試格式的不同，LBA可以測(cè)定游離藥物的濃度或藥物總量。游離藥物是指不與靶點(diǎn)結(jié)合的治療性抗體。藥物總量則指游離的加上結(jié)合了靶標(biāo)的藥物。由于PK數(shù)據(jù)至關(guān)重要，相關(guān)監(jiān)管指南和行業(yè)共識(shí)都對(duì)定量方法的驗(yàn)證提出了相關(guān)建議，包括應(yīng)對(duì)干擾的一些方面。
游離的抗體藥物的測(cè)定通常使用抗原或中和性抗獨(dú)特型抗體(anti-ID)作為捕獲抗體。檢測(cè)抗體可以是中和性anti-ID、非中和性anti-ID、抗人IgG、抗人特定等型（specific isotype）抗體（如抗人IgG2特異性抗體）或抗藥物抗體的框架突變（anti-framework mutations）的抗體。抗體藥物總量可被非中和性anti-ID、抗人IgG、抗人特定等型（specific isotype）抗體或抗藥物抗體的框架突變的抗體捕獲和檢測(cè)。但是，很少能得到非中和性anti-IDs，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下，生產(chǎn)anti-IDs時(shí)會(huì)產(chǎn)生很多中和性anti-IDs，但非中和性anti-IDs的產(chǎn)生量卻很少。
游離抗體藥物的定量在技術(shù)上是具有挑戰(zhàn)性的，特別是當(dāng)可溶性靶標(biāo)在樣本中處于高水平時(shí)，許多基質(zhì)成分可以顯著改變可溶性靶標(biāo)的水平或影響藥物與可溶性靶標(biāo)的結(jié)合，從而引起游離藥物濃度的變化。此外，這些成分也很有可能對(duì)之前所討論的可溶性靶標(biāo)定量起到干擾。
在定量分析抗體-藥物偶聯(lián)物(ADCs)時(shí)，樣本的制備具有特殊意義，因?yàn)锳DCs可以在采集的樣本中或體內(nèi)發(fā)生生物轉(zhuǎn)化，使本已復(fù)雜的ADC生物分析更加復(fù)雜化。
即使是單克隆抗體的定量也會(huì)受到樣本制備方法的影響。例如，使用EDTA作為抗凝劑會(huì)螯合陽(yáng)離子（如Ca2+和Mg2+），從而影響游離抗體藥物濃度的準(zhǔn)確測(cè)定，如果這些陽(yáng)離子是藥物與靶標(biāo)結(jié)合所必需的。
在樣本收集和制備過(guò)程中，不理想的程序（如上半篇提到的生物標(biāo)志物部分所討論的）會(huì)從細(xì)胞中釋放可溶性靶標(biāo)，導(dǎo)致樣本中靶標(biāo)的濃度人為地升高，從而低估了游離抗體的濃度。
為了減少這些潛在的干擾，在對(duì)每個(gè)抗體藥物進(jìn)行分析時(shí)，都應(yīng)該優(yōu)化樣本采集程序和檢測(cè)條件。正如前文所提到的，制備血清的過(guò)程可釋放儲(chǔ)存在血小板中的蛋白質(zhì)，而使用血漿則可避免它的釋放。此外，可以實(shí)施樣本增穩(wěn)的條件，如低溫，可以減少在樣本收集過(guò)程中蛋白質(zhì)從細(xì)胞中釋放出來(lái)的量。在檢測(cè)試劑存在的情況下先進(jìn)行樣本酸解處理，再進(jìn)行中和處理，或在檢測(cè)過(guò)程中保持樣本的弱酸性，該方法已被證明可以有效地減少來(lái)自靶標(biāo)的干擾。
對(duì)于游離抗體藥物的分析，應(yīng)該優(yōu)化檢測(cè)條件，如孵育時(shí)間、捕獲試劑的濃度和最低稀釋要求，以最大限度地減少藥物從它的靶標(biāo)解離。這對(duì)與其靶標(biāo)親和力較低、在血液循環(huán)中可溶性靶標(biāo)濃度較高的抗體藥物，尤為重要。因此，需要在研究人群中評(píng)估稀釋線性度和樣本穩(wěn)定性，以將靶標(biāo)水平的變化對(duì)游離藥物定量的準(zhǔn)確性這一影響納入考慮。
當(dāng)使用抗原捕獲待測(cè)物時(shí)，高濃度的結(jié)合蛋白或可溶性受體（soluble receptor）可能會(huì)飽和捕獲試劑，致使游離藥物的濃度被低估。使用中和性anti-ID，而不是藥物靶標(biāo)，作為捕獲試劑，則可以最大限度的減少這個(gè)問(wèn)題。
樣本中的ADA是基質(zhì)干擾的一個(gè)來(lái)源。ADA與捕獲抗體（或在均相測(cè)試方法中的檢測(cè)抗體），結(jié)合到抗體藥物上，這一競(jìng)爭(zhēng)會(huì)低估抗體藥物的濃度；非競(jìng)爭(zhēng)性ADA可使抗體藥物分子交聯(lián)形成大體量的復(fù)合物，這也會(huì)影響藥物濃度測(cè)定的準(zhǔn)確性。通過(guò)對(duì)PK、PD和ADA的結(jié)果進(jìn)行比較，可以驗(yàn)證研究中是否存在這種干擾，從而相應(yīng)地解釋相關(guān)數(shù)據(jù)。
與生物標(biāo)記物測(cè)定相似，基質(zhì)中的heterophilic抗體和人抗動(dòng)物抗體是免疫測(cè)試中的常見(jiàn)干擾來(lái)源，可以用前述相同的方法來(lái)減輕干擾的影響。如果使用抗人抗體作為捕獲或檢測(cè)試劑，人體基質(zhì)中的人體免疫球蛋白可導(dǎo)致顯著的背景信號(hào)，可以選擇使用Isotype-specific anti-human antibody替代pan anti-human antibody，以減少干擾。
生物藥和完全的人源抗體藥都有可能產(chǎn)生ADA（也稱為抗藥物抗體），會(huì)導(dǎo)致藥物暴露量的損失、藥效損失和嚴(yán)重的不良反應(yīng)。免疫原性評(píng)估是臨床研究中安全性評(píng)估的重要組成部分，ADA通常采用分級(jí)方法進(jìn)行檢測(cè)（篩查）、確認(rèn)和表征。ADA測(cè)定是半定量的，因?yàn)檫@些測(cè)試方法缺乏標(biāo)準(zhǔn)曲線。陽(yáng)性的定義是在測(cè)試切點(diǎn)以上的檢測(cè)信號(hào)，由未接受藥物的陰性樣本的統(tǒng)計(jì)分析確定。
針對(duì)抗體藥ADA的測(cè)定也主要是通過(guò)LBA方法進(jìn)行的。大多數(shù)ADA免疫分析采用橋接測(cè)試格式，即ADA橋接（bridge）/交聯(lián)（crosslink）兩個(gè)藥物分子結(jié)合。對(duì)抗體藥中使用較少的另一種方法是直接結(jié)合免疫測(cè)試（direct binding immunoassays），其中抗體藥是捕獲試劑，檢測(cè)試劑則是檢測(cè)ADA的Fc部分。
在ADA檢測(cè)中最常見(jiàn)的干擾是抗體藥本身，樣本中的藥物與ADA結(jié)合，防止ADA與測(cè)試試劑形成復(fù)合物，在藥物存在的情況下檢測(cè)到ADA的能力，稱為藥物耐藥性。
在臨床和非臨床ADA試驗(yàn)方法驗(yàn)證過(guò)程中，監(jiān)管機(jī)構(gòu)會(huì)要求評(píng)估和排除這樣的干擾，可以通過(guò)在藥物濃度預(yù)期較低的時(shí)間點(diǎn)（drug wash-out phase）收集樣本進(jìn)行ADA測(cè)試來(lái)緩解藥物干擾。在某些情況下，通過(guò)酸分離可以提高藥物耐受性。
（1）使用酸解離藥物-ADA復(fù)合物；
(2)在檢測(cè)試劑的存在的情況下中和樣本；
(3)進(jìn)行測(cè)試
使用高靈敏度的分析方法和稀釋樣本是提高耐藥性的有效方法，用藥物捕獲ADA并通過(guò)Fc區(qū)域檢測(cè)ADA的直接結(jié)合式LBA方法可能較少受到藥物干擾，在這種方法中，只要ADA的一端可與藥物捕獲結(jié)合，就能檢測(cè)到ADA。
橋接的測(cè)試格式則要求ADA的兩端結(jié)合到測(cè)試試劑，Wu等人描述了一個(gè)直接結(jié)合式，以檢測(cè)藥物特異性的ADAs（IgE等型），并通過(guò)萃取抗體量總量，進(jìn)而檢測(cè)copurified 藥物來(lái)定量ADA，這樣可以完全消除藥物干擾。Neubert等人通過(guò)protein G extraction，然后使用LC-MS檢測(cè)copurified藥物，證明了此方法的可行性。表1 列舉了一些用于破壞ADA-藥物復(fù)合物，以提高ADA檢測(cè)靈敏度的方法（詳見(jiàn)擴(kuò)展閱讀#2）。限于篇幅，本文不詳細(xì)逐一討論，請(qǐng)參閱本文末的參考文獻(xiàn)。
樣本基質(zhì)中的藥物靶標(biāo)也可能干擾ADA檢測(cè)，導(dǎo)致假陽(yáng)性或陰性結(jié)果，橋接捕獲和檢測(cè)試劑的multimeric可溶性靶標(biāo)能夠產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。有報(bào)道稱，在ADA測(cè)試中，含有CD20的細(xì)胞膜片段會(huì)對(duì)atumumab產(chǎn)生基質(zhì)干擾，陰性結(jié)果可能是由于可溶性靶標(biāo)與捕獲和/或檢測(cè)抗體結(jié)合，從而阻斷中和性ADA的檢測(cè)。下面的樣本預(yù)處理，即用阻斷性抗體結(jié)合靶標(biāo)，或用結(jié)合蛋白對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行阻斷以及免疫消耗靶標(biāo)，都可以消除這種干擾。例如，在針對(duì)ranibizumab的ADA方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中得到了證實(shí)。
雖然，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為未使用生物藥的個(gè)人不會(huì)有ADA，但有時(shí)在給藥前就會(huì)檢測(cè)到先前存在的抗體。值得一提的是，先前存在的抗體并不是干擾，且可能結(jié)合到抗體藥物的任何地方。例如，檢測(cè)到并確認(rèn)了對(duì)panitumumab的中和性ADA，但報(bào)道說(shuō)這些交叉反應(yīng)性抗體并未改變藥物PK或其安全性。
盡管如此，先前的ADA總是使得測(cè)試和結(jié)果解釋變得更復(fù)雜。滴度和特異性測(cè)試有助于了解先前存在的抗體對(duì)給藥后ADA發(fā)生率的貢獻(xiàn)，針對(duì)cetuximab的先前存在的抗體有臨床相關(guān)性，即先前存在的IgE抗體與嚴(yán)重的超敏反應(yīng)有關(guān)。當(dāng)一個(gè)抗體藥物含有某個(gè)天然蛋白的免疫原性結(jié)構(gòu)域而且大多數(shù)人以前可能接觸到該結(jié)構(gòu)域時(shí)，就很可能會(huì)有預(yù)先存在的ADAs。在recombinant therapeutic immunotoxins，即anti-CD3-diptheria toxin 和anti-CD22 Pseudomonas exotoxin A的臨床研究中，就觀察到先前存在的ADA。
表1. 用于破壞ADA-藥物復(fù)合物，以提高ADA檢測(cè)靈敏度的方法
在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中較為常見(jiàn)的類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)，它是針對(duì)IgG的Fc區(qū)域的抗體，主要為IgM等型抗體。RF的結(jié)合親和力低，預(yù)期不會(huì)在ADA測(cè)試中產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)，然而工程改造過(guò)的抗體藥物可能對(duì)RF有更高的親和力，從而可能在ADA檢測(cè)中產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)。Araujo等人證明，在給藥前的樣本中，RF產(chǎn)生了陽(yáng)性信號(hào)，而使用抗人IgM抗體的樣本預(yù)處理會(huì)減少RF的作用。這種方法可能會(huì)影響IgM等型的ADA檢測(cè)，作者篩查了含有和不含有抗IgM抗體的樣本，并監(jiān)測(cè)藥物治療期間滴度的增加。
可溶性蛋白生物標(biāo)志物、治療性抗體和ADA的生物分析是藥物開(kāi)發(fā)中不可分割的一部分，每一種分析物都有其自身的挑戰(zhàn)。避免基質(zhì)干擾最有效的方法是對(duì)靶標(biāo)生物學(xué)和待測(cè)物本身具有扎實(shí)的理論基礎(chǔ)，并著重關(guān)注測(cè)試/分析方法的特異性。
分析技術(shù)也可能在防止或減輕測(cè)試干擾方面發(fā)揮重要作用。在很多情況下，稀釋是減少干擾的有效工具，而最高的稀釋倍數(shù)受到檢測(cè)靈敏度的限制。高靈敏度的分析平臺(tái)在高稀釋條件下，可以提供有效的工具，以盡量減少來(lái)自基質(zhì)的干擾，分離和純化技術(shù)的改進(jìn)可以有效地將待測(cè)物從干擾因子中分離出來(lái)。例如，在ADA分析中，有效地從抗體藥物-ADA復(fù)合物中定量分離出ADA就能解決其藥物耐受性問(wèn)題。
MS與LC結(jié)合已經(jīng)成為一種強(qiáng)大的定量方法，并且越來(lái)越多的應(yīng)用在蛋白藥物 (尤其是抗體藥物偶聯(lián)物)和生物標(biāo)志物的生物分析上。與LBA方法相比較，干擾對(duì)它的似乎不那么重要，因?yàn)镸S是特異性很強(qiáng)的分析方法。雖然分析特異性在完全消除干擾方面會(huì)非常有幫助，但如果待測(cè)物在生物學(xué)上是完全等同的（identical），它也可能使生物分析變得極其復(fù)雜。
在許多情況下，MS能夠檢測(cè)許多不同待測(cè)物的混合物，而LBA方法只能檢測(cè)一種待測(cè)物。因此，LC-MS/MS在生物分析中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。本系列后續(xù)文章將介紹大分子生物分析中LC-MS/MS方法。敬請(qǐng)關(guān)注。
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