限于篇幅，本文只探討3個(gè)議題，對(duì)其它相關(guān)問題感興趣的讀者請(qǐng)閱文末的參考文獻(xiàn)。
將ELISA方法轉(zhuǎn)移到其它分析平臺(tái)
在開發(fā)臨床前LBA分析方法時(shí)，ELISA可能是首選的方法，因其簡(jiǎn)單性，低成本，并且不需要專門的儀器設(shè)備。但是，如果ELISA方法不能滿足靈敏度和穩(wěn)健性要求時(shí)，特別是對(duì)GLP毒理/毒代研究而言，需要在一個(gè)CRO實(shí)施該研究時(shí)，往往需要將一個(gè)ELISA方法轉(zhuǎn)移到MSD或者GYROS平臺(tái)至上實(shí)施。
MSD
從ELISA轉(zhuǎn)移到MSD平臺(tái)相對(duì)簡(jiǎn)單；當(dāng)使用特定抗體對(duì)的ELISA方法無(wú)法到達(dá)所需要的靈敏度時(shí)，會(huì)經(jīng)常實(shí)施這樣的轉(zhuǎn)移來(lái)減少基質(zhì)效應(yīng)，提高靈敏度或增加定量動(dòng)態(tài)范圍。然而，就像其它方法轉(zhuǎn)移一樣，試劑的差異和不同的修飾（modifications），如ruthenium或生物素標(biāo)記，可能會(huì)影響方法的效能。因此，雖然可以在MSD上重新使用已有的抗體對(duì)和測(cè)試格式，但將需要調(diào)整校準(zhǔn)品（Cs）和QCs的濃度，并充分驗(yàn)證新的方法。
Gyrolab
在理想的情況下，需要小體積樣本或半自動(dòng)化的分析方法應(yīng)當(dāng)直接在Gyrolab平臺(tái)上開發(fā)。如果一對(duì)抗體（antibody pair）可用于相同的捕獲-檢測(cè)組合，則將ELISA方法直接成功地轉(zhuǎn)移到Gyrolab上的可能性更大； 盡管可能需要重新優(yōu)化，以提高靈敏度和/或擴(kuò)展動(dòng)態(tài)范圍。 重新優(yōu)化包括測(cè)試抗體對(duì)的組合；調(diào)整抗體濃度，以最大化靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍；測(cè)試選擇性，以盡量減少M(fèi)RD；以及重建動(dòng)態(tài)范圍和QC水平。在轉(zhuǎn)移方法到Gyrolab平臺(tái)的時(shí)候，修改試劑，如使用生物素（biotin）或熒光標(biāo)記，也會(huì)影響測(cè)定性能。在任何情況下，都需要在此平臺(tái)實(shí)施完全的方法驗(yàn)證。
BIAcore
BIAcore和ELISA之間的差異太大，不能直接轉(zhuǎn)移分析方法；因此，需要進(jìn)行方法的再開發(fā)，和全面的方法驗(yàn)證。 由于BIAcore是一個(gè)基于流體的系統(tǒng)，因此不宜直接與基于固相（例如，微孔板）的免疫測(cè)試方法進(jìn)行比較。需要進(jìn)一步開發(fā)BIAcore方法，例如芯片的固定（immobilization）和再生條件，用于固定和再生緩沖液的試劑，試劑的穩(wěn)定性，確定標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)量控制樣品，以及配體結(jié)合測(cè)試（LBA）方法的其他方面。
Luminex
如果以Luminex格式定量單個(gè)待測(cè)物，則從ELISA格式的方法轉(zhuǎn)移在測(cè)試方法的布局方面非常簡(jiǎn)單，盡管需要制備，評(píng)估和驗(yàn)證新的試劑（例如，dye-coated beads，熒光標(biāo)記的檢測(cè)抗體）。有時(shí)，在洗滌步驟中需要額外的微孔板（真空或磁珠板）。如果需要將多個(gè)ELISA方法組合并轉(zhuǎn)移到一個(gè)Luminex方法（由于其multiplexing功能），則需要進(jìn)行額外的研究；并且，優(yōu)化方法參數(shù)可能需要更多的方法開發(fā)時(shí)間。總體而言，必須全面驗(yàn)證單通路和multiplex格式的Luminex方法；ELISA方法中使用的條件有助于確定開發(fā)Luminex方法的格式和抗體對(duì)。
分析大數(shù)量樣本和儀器故障
MSD
對(duì)于在MSD上的樣本分析，校準(zhǔn)品（Cs）和QCs的位置通常與ELISA的位置相同。另一方面，值得注意的是：對(duì)微孔板一次只讀取四個(gè)孔的數(shù)據(jù)，而且在施加電壓后只能讀取一次。因此，如果發(fā)生儀器故障，可能無(wú)法測(cè)定整個(gè)校準(zhǔn)曲線；或者取決于微孔板設(shè)置（plate set-up），可能缺少一組QC的一部分，這通常發(fā)生在水平設(shè)置（horizontal set-up）中。對(duì)于垂直設(shè)置（vertical set-up），更有可能獲得校準(zhǔn)品和第1組QC，而不是第二組QC。在這兩種情況下，將需要重新讀取整個(gè)微孔板。如果儀器發(fā)生故障，而且讀數(shù)緩沖液已添加到微孔板中，則可能需要重新分析（re-assay）樣品，因?yàn)闄z測(cè)信號(hào)會(huì)隨時(shí)間顯著地減少。
Gyrolab
通常，一個(gè)分析運(yùn)行被定義為一個(gè)CD，在每個(gè)CD上都放置有校準(zhǔn)品和 QCs。如果放置在不同CDs上的QCs的精密度和偏差符合接受標(biāo)準(zhǔn)，則在無(wú)人值守的運(yùn)行中處理的最多五張CDs的系列可以定義為一個(gè)單次運(yùn)行。 這需要測(cè)試和評(píng)估一個(gè)給定的格式是否滿足上述接受標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)檫@取決于能否快速捕獲待測(cè)物的和試劑的穩(wěn)定性。
需要將接受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于每個(gè)CD，這意味著具有失敗的QCs和/或失敗校準(zhǔn)曲線的CDs會(huì)被拒絕，而來(lái)自同一個(gè)多個(gè)CD運(yùn)行中的其它CDs可以通過。如果含多個(gè)CD的運(yùn)行僅有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且此曲線不符合接受條件，則此多個(gè)CD的運(yùn)行的所有數(shù)據(jù)將被拒絕。由于多個(gè)CD運(yùn)行的風(fēng)險(xiǎn)，故應(yīng)在方法驗(yàn)證時(shí)，需要對(duì)樣品分析時(shí)的校準(zhǔn)曲線和QCs設(shè)置進(jìn)行評(píng)估。在任何情況下，每個(gè)CD都必須含有QCs。
如果在運(yùn)行過程中懷疑針頭故障，例如，觀察到結(jié)構(gòu)之間（inter-structure）高的CVs，則需要使用供應(yīng)商提供的儀器日常維護(hù)測(cè)試方法，測(cè)試液體處理裝置的性能。故可以識(shí)別不符合接受標(biāo)準(zhǔn)的樣本，校準(zhǔn)品或QCs所使用的針頭，并可以在未來(lái)的運(yùn)行中重新分析。液體處理裝置有10個(gè)針頭，分析數(shù)據(jù)指明了用于轉(zhuǎn)移某一樣本的針頭。
一些較新的LBA分析平臺(tái)，包括Gyrolab，提供比ELISA更寬泛的動(dòng)態(tài)范圍。盡管如此，仍建議使用相同數(shù)量的校準(zhǔn)品和 QCs（在每個(gè)CD/微孔板的每個(gè)QC級(jí)別重復(fù)兩次）進(jìn)行驗(yàn)證（LLOQ，LQC，MQC，HQC，ULOQ）和樣品分析（LQC，MQC，HQC），如同對(duì)ELISA方法建議的那樣。
Luminex
常見的做法是設(shè)置板中（in-plate）校準(zhǔn)品，并重復(fù)（duplicate）分析校準(zhǔn)品和樣本。校準(zhǔn)品的范圍通常比 ELISA的范圍更寬，以適應(yīng)各種待測(cè)物濃度，并確定每個(gè)待測(cè)物的校準(zhǔn)曲線和QCs響應(yīng)。值得指出，對(duì)于另一種待測(cè)物，校準(zhǔn)曲線上的錨定點(diǎn)可能不一樣。
如果儀器在運(yùn)行中失敗（即，產(chǎn)生一個(gè)部分運(yùn)行partial run），只要相關(guān)校準(zhǔn)品和QCs成功完成且可以接受，則仍然可以使用已分析樣本的數(shù)據(jù)。與某些順序測(cè)定平臺(tái)（sequential platforms）相比，這不太令人擔(dān)心；而在那些順序平臺(tái)上，只有有限的QCs位于相對(duì)較大量的樣本之間；這樣的話，就可能沒有足夠的QCs來(lái)判斷許多樣本分析的結(jié)果是否有效。
BIAcore
該平臺(tái)與RIA一樣，系列式地（in series）分析樣品，并使用微孔板加載樣本。因此，有兩種方法可以運(yùn)行 BIAcore 樣本分析。與 ELISA一樣，按96孔，設(shè)置校準(zhǔn)品和QCs；或者將兩個(gè)板（或更多）可以作為一個(gè)整體來(lái)運(yùn)行：在開始時(shí)，分析校準(zhǔn)品，并且在整個(gè)樣本分析中穿插幾組QCs。產(chǎn)生部分運(yùn)行結(jié)果的原因，可能是由于儀器故障；也可能是由于未知原因?qū)е翾C失敗。應(yīng)根據(jù)發(fā)生的情況和時(shí)間處理儀器故障。在由于未知原因?qū)е翾C失敗的情況下，當(dāng)兩組已接受的QCs之間的所有樣本都需要重新分析時(shí)，可以使用bracket approach，如表3所示。
表3. Biacore樣本分析設(shè)置
總體而言，如果40%或更多個(gè)QC失敗，則必須重新分析，在可接受的最后一組QC之后的，所有樣本。只有在運(yùn)行開始時(shí)的一組QC都通過了的情況下，才能接受第一組樣本的分析結(jié)果。如果QC的成功和失敗是零星的（sporadic），則整個(gè)樣本分析運(yùn)行失敗，必須進(jìn)行原因調(diào)查。RIA使用類似的方法，系列式地分析一組試管。
實(shí)施樣本分析的最佳實(shí)踐
1.在方法開發(fā)的過程中，最好消除殘留（carry-over），而不是在樣本分析中加以計(jì)算校正。
2.對(duì)于每個(gè)平臺(tái)，應(yīng)使用短期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)來(lái)確定每次運(yùn)行的持續(xù)時(shí)間，以確保樣本穩(wěn)定性。
3.一個(gè)分析運(yùn)行不限于96個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)（校準(zhǔn)品加樣本）；例如，對(duì)于基于不同硬件支持，如CD和/或系列運(yùn)行[run in series]，如RIA，BIAcore，Erenna®，和 Gyrolab的平臺(tái)。
4.在分析運(yùn)行開始時(shí)，首先分析標(biāo)（校）準(zhǔn)曲線；之后，以合理的頻率在運(yùn)行中間隔地分析QCs，以驗(yàn)證該分析平臺(tái)上的結(jié)果。取決于如何定義一個(gè)分析運(yùn)行，可以在每個(gè)固體支持（solid support）上設(shè)置校準(zhǔn)品，也可以設(shè)置在一個(gè)微孔板/CD上；之后是QCs間隔的一系列樣本。無(wú)論一個(gè)分析運(yùn)行是如何定義的，應(yīng)當(dāng)有規(guī)律地多次分析QCs，以確認(rèn)運(yùn)行內(nèi)的精密度。
5.只要在方法驗(yàn)證期間確定的%CV在可接受的范圍內(nèi)，例如，小于或等于目前能夠接受的15%（對(duì)小分子而言），則可以進(jìn)行單個(gè)樣品分析，并采用最嚴(yán)格的接受標(biāo)準(zhǔn)。如果運(yùn)行超過多個(gè)固體支持，則%CV標(biāo)準(zhǔn)指的是重復(fù)（duplicate）運(yùn)行的QCs，和包括多個(gè)固體支持的運(yùn)行內(nèi)精密度。
6.對(duì)于方法轉(zhuǎn)移，在更改分析方法的平臺(tái)或格式時(shí)，大多數(shù)平臺(tái)需要重新驗(yàn)證；即便是部分驗(yàn)證也可能錯(cuò)過對(duì)一些關(guān)鍵參數(shù)的評(píng)估。因此，建議對(duì)樣本分析方法進(jìn)行完整的重新驗(yàn)證。
7.Multiplexing：建議盡可能在待測(cè)物的混合物中，驗(yàn)證每一個(gè)待測(cè)物。在樣本分析期間，如果一個(gè)待測(cè)物的分析失敗，則應(yīng)重新分析所有樣本，并屏蔽先前合格待測(cè)物的分析結(jié)果。
總結(jié)與前瞻
總之，大多數(shù)藥物發(fā)現(xiàn)階段的PK/PD免疫分析可以在MSD或Gyrolab平臺(tái)上進(jìn)行。Gyrolab還具有運(yùn)行時(shí)間短，樣本體積小和自動(dòng)化，等附加優(yōu)勢(shì)，因此對(duì)臨床前生物分析極具吸引力。無(wú)論分析平臺(tái)如何，本文強(qiáng)烈建議，在最終所需分析方法的同一平臺(tái)上，篩選試劑和評(píng)估方法的性能。在另一方面，超高靈敏度和multiplexing平臺(tái)是特殊的應(yīng)用平臺(tái)，通常不能對(duì)試劑進(jìn)行高通量篩選。因此，可以首先在ELISA，MSD，Gyrolab或BIAcore（SPR技術(shù)）平臺(tái)上對(duì)試劑進(jìn)行篩選，然后在相關(guān)特殊平臺(tái)上優(yōu)化并最終建立相關(guān)方法。Simoa™平臺(tái)因其超高靈敏度（可以使用微量樣本體積）和自動(dòng)化操作，在相當(dāng)?shù)某潭壬峡梢蕴娲鶪yrolab平臺(tái)，用于臨床前PK樣本分析。
針對(duì)可溶性靶標(biāo)的新藥項(xiàng)目，需要在方法開發(fā)的開始，就利用BIAcore平臺(tái)使用的SPR技術(shù)來(lái)克服耐受性（tolerance）問題。選擇分析平臺(tái)時(shí)，應(yīng)當(dāng)牢記最終目標(biāo)。雖然獲得完美的方法參數(shù)是最理想的，但就檢測(cè)方法的局限性和項(xiàng)目需求而言，需要切合實(shí)際；因此，需要有愿意在使用的樣本體積或分析運(yùn)行的時(shí)間，等參數(shù)上，做出妥協(xié)，以滿足整體需求。與項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)良好的溝通有助于確定相關(guān)工作的優(yōu)先級(jí)別，滿足對(duì)分析方法的需求并滿足相關(guān)時(shí)間表。當(dāng)項(xiàng)目的目標(biāo)預(yù)期發(fā)生變化時(shí)，需要對(duì)分析方法的格式保持足夠的靈活性，以便在不同的分析平臺(tái)之間，輕松地轉(zhuǎn)移分析方法。
每個(gè)平臺(tái)在檢測(cè)試劑，如Sulfo-tag、horseradish peroxidase（HRP或其他酶）方面，差異最大。因此，試劑的生物素化（biotinylation），當(dāng)與各自對(duì)應(yīng)的鏈球菌蛋白標(biāo)記的試劑（streptavidin-tagged reagents）一起使用時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)分析方法在這些平臺(tái)之間的無(wú)縫轉(zhuǎn)移。在需要將捕獲試劑生物素化的平臺(tái)（Gyrolab）上，這些生物素化的試劑可以作為捕獲（capture）使用。無(wú)論是分析針對(duì)可溶性靶標(biāo)的藥物的游離的，還是結(jié)合的百分比，或是分析復(fù)雜分子的分子完整性，都應(yīng)當(dāng)利用免疫測(cè)試方法的多功能性（versatility），并相應(yīng)地考慮合適的分析平臺(tái)。雖然免疫分析領(lǐng)域正在迅速發(fā)展，但LC-MS等正交性生物分析平臺(tái)也在平行地發(fā)展，有時(shí)可以作為免疫分析方法的補(bǔ)充。因此，充分了解正交分析平臺(tái)，并及時(shí)向這些平臺(tái)的團(tuán)隊(duì)提示研究方向，將有助于項(xiàng)目的成功。后續(xù)文章將介紹相關(guān)進(jìn)展，敬請(qǐng)關(guān)注。
特別聲明
本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請(qǐng)讀者評(píng)論和指正。所有引用的原始信息和資料均來(lái)自已經(jīng)發(fā)表學(xué)術(shù)期刊、官方網(wǎng)絡(luò)報(bào)道等公開渠道, 不涉及任何保密信息。 參考文獻(xiàn)的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價(jià)值的文獻(xiàn)及其評(píng)估。
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