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博濟醫(yī)藥科技股份有限公司
股票代碼為（300404）創(chuàng)建于2002年，2015年在深圳創(chuàng)業(yè)板上市，是一家為國內(nèi)外醫(yī)藥企業(yè)提供藥品、保健品、醫(yī)療器械研發(fā)與生產(chǎn)全流程“一站式”外包服務(wù)(CRO)的型高新技術(shù)企業(yè)，同也提供藥品上市許可持有人(MAH)服務(wù)。
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藥品研發(fā)“一站式”服務(wù)包括：新藥立項研究和活性篩選、藥學研究(含中試生產(chǎn))、藥理毒理研究、臨床用藥與模擬劑的生產(chǎn)、臨床試驗、臨床數(shù)據(jù)管理和統(tǒng)計分析、上市后再評價、技
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公司擁有近3000平米的現(xiàn)代化辦公場所，匯聚了超1000名經(jīng)驗豐富，學識淵博，思維敏捷的中高級醫(yī)藥研究人才和注冊法規(guī)專家。
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博濟醫(yī)藥始終堅持“誠實、守信、專業(yè)、權(quán)威”的經(jīng)營理念，截至2020年，公司累計為客戶提供臨床研究服務(wù)800余項，基本涵蓋了藥物治療的各個專業(yè)領(lǐng)域;累計完成臨床前研究服務(wù)500多項。經(jīng)過近二十年的發(fā)展，博濟醫(yī)藥在技術(shù)實力、服務(wù)質(zhì)量、服務(wù)范圍、營業(yè)收入、團隊建設(shè)等方面都已躋身我國CRO公司的領(lǐng)先位置，成為我國本土大型CRO公司的龍頭企業(yè)。
公司新聞
袁來如此 | 大分子生物分析概論（十四_上）：LBA定量分析雙特異性生物藥的挑戰(zhàn)
作者：廣州博濟醫(yī)藥 時間：2021-08-18 來源：廣州博濟醫(yī)藥
     本文為系列文章《大分子生物分析概論》的第十四篇，旨在根據(jù)已發(fā)表的文獻資料，初步的介紹定量分析雙特異性抗體的LBA方法所面臨的挑戰(zhàn)。
 
     由于內(nèi)容篇幅較長，本文將采取上下篇形式進行推送，敬請垂注！《袁來如此》專欄系廣州博濟醫(yī)藥微信公眾號打造的科普學術(shù)專欄，內(nèi)容均為博濟醫(yī)藥藥物研究中心資深科學顧問袁智博士原創(chuàng)。

 
     與傳統(tǒng)（單特異性）的生物藥相比，雙特異性生物藥對其藥代動力學（PK）的表征提出了獨特的挑戰(zhàn)。在此背景下，開發(fā)生物藥的生物分析策略正在迅速演變，以支持這些不斷變化的藥物模式。


     一般說來，生物分析策略應(yīng)根據(jù)藥物的作用機制（mechanism of action，MOA）和開發(fā)階段定制。對于 mAb 藥物，用于分析藥代/毒代動力學（PK/TK），藥效動力學和免疫原性的分析方法通常分別為定量分析、“游離”和“總”藥物濃度、“游離”和“總”靶標濃度、抗藥物抗體（ADAs）和中和性 ADAs的開發(fā)和驗證。對于具有復雜結(jié)構(gòu)的抗體衍生物（antibody derivatives），衍生物的每個功能域可能需要額外的一組檢測方法，從而可能導致測試方法的數(shù)量幾何級增長。


     此外，與開發(fā)默認沒有生物轉(zhuǎn)化（biotransformation）的mAb相比，復雜的抗體衍生物更容易發(fā)生生物轉(zhuǎn)化，這意味著可能需要另一組測試方法來描述復雜抗體藥物的結(jié)構(gòu)完整性及其生物轉(zhuǎn)化后的各種產(chǎn)物（biotransformed variants）。


     配體結(jié)合式測試方法（LBA）是mAbs生物分析的主力軍，同時液相色譜-質(zhì)譜方法（LC-MS）也在近年越來越受歡迎。這兩種分析技術(shù)也主要應(yīng)用于抗體藥物及其衍生物的生物分析。

 
     由于藥物模式的復雜性，通常需要多個 LBA/LC-MS 分析方法。當每個分析方法都有特定的取樣程序，而且并非所有的檢測可以在一個生物分析實驗室實施時，獨特的樣本采集、處理、儲存、運輸和分析條件，會造成復雜的后勤需求。因此，需要設(shè)計一種生物分析策略，用于表征雙特異性分子的PK特性，并研究其體內(nèi)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。本文提供了若干相關(guān)案例研究和監(jiān)管層面的預測。

導論

    近年來，蛋白質(zhì)工程和生產(chǎn)方面的進展推動著生物制藥行業(yè)開發(fā)越來越復雜的蛋白質(zhì)藥物，其能夠結(jié)合多個藥物治療靶標，故能夠提高療效和/或者減少劑量，用以降低毒性，使安全風險最小化，提高用藥的方便性和依從性等。雙特異性藥物被定義為基于抗體（antibody-based）或基于框架（scaffold-based）的蛋白質(zhì)藥物，其包含一個以上的工程改造功能區(qū)域，該功能區(qū)域結(jié)合兩個或多個獨立的抗原靶點。本文集中關(guān)注雙特異性藥物的兩個獨特的功能域，其結(jié)合與疾病的發(fā)生和進展相關(guān)的蛋白質(zhì)，而不考慮抗體骨（主）干（antibody backbone）的功能。


    開發(fā)雙特異性生物藥的領(lǐng)域，基于并發(fā)展了傳統(tǒng)的單分子靶點的抗體免疫療法的框架，正在蓬勃發(fā)展，以靶向協(xié)同的分子途徑（target synergistic molecular pathways）來更有效地治療疾病。兩種雙特異性抗體，blinatumomab（Blincyto）和catumaxomab（Removab）已經(jīng)在美國或歐盟批準上市，用于腫瘤適應(yīng)癥的治療；這證明了這類藥物分子的應(yīng)用價值。目前有60多種用于癌癥和其它疾病的新型雙特異性生物藥正在臨床開發(fā)之中。


雙特異性生物藥分子


     雙特異性分子可以以各種不同的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)，利用抗體可用的各種結(jié)合域。這些結(jié)合域包括可變重鏈(VH)、可變輕鏈(VL)、單鏈分子(ScFv)和/或抗體的Fc域，可以組合使用這些結(jié)構(gòu)域，以結(jié)合多個分子靶標。具有多個Fab結(jié)合域的雙可變域免疫球蛋白(dual-variable domain immunoglobulin，DVD -Ig)這樣的大型免疫球蛋白分子和較小的串聯(lián)ScFv結(jié)構(gòu)域(diabody)，在分子大小和結(jié)構(gòu)上代表了兩個極端，它們都可通過各種蛋白質(zhì)工程技術(shù)生產(chǎn)出來(圖1)。

    圖1. 雙特異性分子的構(gòu)造。本圖展示了三個雙特異性抗體的例子：1. Hetero-lg；2.雙可變結(jié)構(gòu)域/dual variable domain；3.antibody-peptibody；這些代表了不同的分子大小，結(jié)構(gòu)及復雜性。



      目前的技術(shù)允許蛋白質(zhì)結(jié)合域（protein binding domains）和抗體支架（antibody scaffolding）的多種組合，形成一系列獨特的藥物模式（drug modalities）。雙特異性藥物的幾個功能類別包括：與可溶性靶標結(jié)合以抑制或刺激相關(guān)功能、與細胞靶標結(jié)合以拮抗或刺激相關(guān)功能、與細胞靶標結(jié)合以招募免疫細胞以促進抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)功能。


     對雙特異性分子獨特的結(jié)構(gòu)和作用機制(MOA)給藥代動力學和藥理學(PK/PD)評估，體內(nèi)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的確定以及臨床前和臨床藥物開發(fā)階段所需的生物分析支持帶來了新的挑戰(zhàn)。


雙特異性抗體

     雙特異性抗體是通過基因工程重組生產(chǎn)的抗體，由兩個不同的結(jié)合域（two distinct binding domains）組成，能夠結(jié)合兩種不同的抗原或同一抗原的兩個不同表位。它們可以分為兩個主要類別，即帶有或缺少Fc區(qū)域的兩類。關(guān)于生物分析支持， FDA關(guān)于雙特異性抗體開發(fā)的指南指出：可能需要開發(fā)多種PK定量方法，以定量總（total），結(jié)合（bound）和未結(jié)合（unbound）的雙特異性抗體的濃度；也可能需要多個免疫原性測試方法，來測試對雙特異性抗體不同結(jié)構(gòu)域的免疫反應(yīng)。

 
 
     由于雙特異的性質(zhì)，雙特異性抗體的未結(jié)合或“游離”PK定量方法可以包括三個測定方法：一個雙功能方法同時測定兩個活性結(jié)合域（active binding domains）和兩個單功能方法分別測定二個結(jié)合域中之一。雙功能方法分別使用兩個靶標蛋白作為捕獲和檢測試劑。單功能方法使用一個靶標蛋白作為捕獲試劑，而使用抗人類IgG作為檢測試劑。通常，在解釋檢測結(jié)果時應(yīng)謹慎，因為單特異性方法缺乏特異性，故也能檢測到雙功能分子。


     雙特異性抗體的定量PK分析方法面臨生物轉(zhuǎn)化（biotransformation）的重大挑戰(zhàn)，因此，通常定制開發(fā)方法以定量某個功能域生物轉(zhuǎn)化的程度。獨特的雙特異性構(gòu)造可能造成意外的生物轉(zhuǎn)化路徑，并可能使PK行為復雜化。


雙特異性生物藥的PK/PD


    雙特異性分子增加了PK建模的復雜性，例如，表征靶向介導的藥物處置需要考慮兩個靶點的表達，它們以不同的頻率出現(xiàn)在不同的細胞類型上。“游離”藥物濃度與“總”藥物濃度的定量，對于PK/PD建模至關(guān)重要，特別是當涉及可溶性靶點時；但是，由于靶標蛋白在體內(nèi)的不同表達模式（expression patterns），藥物定量分析可能會變得更加復雜。在絕大多數(shù)的臨床研究中，藥物濃度是在所謂的“中央隔室central compartment”或系統(tǒng)循環(huán)（systemic circulation）中，以血漿或血清樣本的形式，測定的，這在很大程度上是由于易于從服用藥物的受試者中取樣。根據(jù)幾十年累積的科學數(shù)據(jù)，系統(tǒng)藥物濃度（systemic drug concentrations）反映了藥物在靶標作用部位的濃度。血液病是一個例外，但即使是血液病也通常含有固體組織的部分。系統(tǒng)藥物濃度和作用地點（site-of-action）的藥物濃度之間的關(guān)系會因作用地點的不同而不同，但適當?shù)膭游锬Ｐ蛿?shù)據(jù)通常為人體狀況提供了可靠的模型。

 
     由于藥理學或藥效學響應(yīng)依賴于全身藥物濃度，正確理解PK-PD關(guān)系對于預測達到預期響應(yīng)的劑量和暴露量極為有用。同樣重要的是，確定可能發(fā)生在每個獨特的雙特異性分子上的任何潛在的體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化（in vivo biotransformation），并徹底表征不同的藥物在暴露量和活性方面的差異。總體來說，這些表征有助于理解藥物的暴露量-響應(yīng)關(guān)系，并提供了，基于藥物變構(gòu)體活性，優(yōu)化劑量設(shè)計方案。


    PK評估是非臨床毒理學研究和臨床開發(fā)的必然需求，在非臨床疾病模型評估中也發(fā)揮著重要作用；一般在非臨床疾病模型評估中，研究藥物劑量-響應(yīng)的特性，用以選擇先導藥物。非臨床毒理學研究中的全身暴露量數(shù)據(jù)，可用于確定首次對人(FIH)研究的安全起始劑量，該起始劑量是基于此類安全研究確定的暴露量余量（exposure margin）。暴露量余量由未觀察到不良反應(yīng)水平(NOAEL)的動物暴露量與選定人體劑量的預期暴露量的比值確定，通常設(shè)定為比NOAEL預期的人體等效劑量(HED)低10倍。由于雙特異性分子可靶向多種生理或病理途徑，因而可能具有更強的藥理和/或毒理學作用；故監(jiān)管機構(gòu)可能要求制藥商使用“最低預期生物效應(yīng)水平”（MABEL）模型來選擇FIH劑量,這意味著需要比基于NOAEL更低的起始劑量。臨床研究中較低的起始劑量，意味著可能需要提高PK方法的靈敏度；考慮到雙特異性分子的復雜性，這可能是一個挑戰(zhàn)。

 
PK定量分析方法

 
    為了支持符合藥物預期用途的PK數(shù)據(jù)的可靠性和有效性，監(jiān)管機構(gòu)希望制藥商，對所有的GLP研究/關(guān)鍵臨床試驗，使用經(jīng)過驗證的分析方法來定量藥物濃度。監(jiān)管部門為生物分析方法的驗證提供了具體的指南，這些指南在全球各監(jiān)管機構(gòu)中普遍一致。這些指南文件清楚地闡明了對分析方法參數(shù)的性能及其可接受值的監(jiān)管期望，包括收集，儲存和分析過程中研究樣本的完整性。關(guān)于檢測試劑的討論，特別是捕獲和檢測試劑的選擇，分析格式和技術(shù)平臺，以及用于PK表征和PK/PD相關(guān)性分析的相關(guān)待測物，都可以在科學文獻中找到。對于靶標在血液循環(huán)中的藥物（這些靶標可在血清或血漿樣本中形成藥物-靶標復合物），關(guān)于應(yīng)當測定的最相關(guān)的藥物形式(不包括生物轉(zhuǎn)化物/ biotransformants)仍然存在爭議:“總體”(結(jié)合了 + 未結(jié)合靶標的藥物)或“游離部分”或“活性部分”(未結(jié)合靶標的部分)。關(guān)于總藥物濃度和游離藥物濃度的問題最好根據(jù)靶標的已知狀況，藥物的MOA和特征，項目團隊的意見，技術(shù)可行性，以及監(jiān)管反饋（如果需要的話），按個案處理的原則解決。最近有文獻討論了相關(guān)問題。


LBA定量方法


   生物分析策略的選擇可以根據(jù)藥物特定的開發(fā)階段而有所不同。例如,在非臨床物種中研究人類蛋白藥物, 使用不與非人類物種交叉反應(yīng)的，針對人類蛋白的試劑，特別是非人靈長類同源物，例如,重組人源化單克隆抗體（recombinant humanized monoclonal antibody，rhuMabs）,可以開發(fā)一種通用的，快速且經(jīng)濟的PK分析方法來測定總藥物濃度，以支持全面的毒理學評價。然而,這種方法不能用在臨床研究中,更加藥物特異性試劑，例如，靶標抗體和anti-idiotypic抗體，更可能是必要的：使用通用試劑與內(nèi)源性分子發(fā)生交叉反應(yīng)會干擾蛋白藥物濃度的定量，而測定游離藥物的濃度與建立PK-PD關(guān)系息息相關(guān)。非臨床和臨床生物分析策略的另一個問題是，使用針對每個靶標結(jié)合位點（target binding site）的試劑，例如針對每個靶標結(jié)合域的靶標和/或anti-idiotypic抗體的組合，來測定完整的雙特異性分子是否最有價值。

Anti-idiotypic 抗體

   當一種抗體與另一種抗體的idiotope結(jié)合時，它被稱為抗idiotope抗體。抗體的可變部分，包括獨特的抗原結(jié)合位點，被稱為idiotope。Idiotopes內(nèi)的表位組合對于每種抗體都是獨一無二的(圖2).由于目前開發(fā)的大多數(shù)單克隆抗體藥物是人源的或人源化的，因此最可能誘導抗藥物抗體（ADA）的免疫原性表位（immunogenic epitopes），存在于提供大多數(shù)結(jié)合接觸面（binding contacts）的hypervariable complementarity determining regions（CDR）之內(nèi)。可以生成抗idiotypic抗體，特異性地結(jié)合一個單克隆抗體藥物。這些高度特異性的抗體可用于，以不同測試格式，開發(fā)藥代動力學（PK）定量方法，以測定臨床前和臨床樣本中的游離藥或總藥物的濃度，或在ADA測試中作為陽性對照等。

圖2. 抗體idiotope：抗體可變區(qū)域的，獨特的抗原決定因素（antigenic determinants）的集合。



    在這方面，藥物的MOA在選擇合適的分析方法時很重要，特別是在藥物活性依賴于雙特異性藥物對兩個靶點的同時作用的情況下。抗CD3/抗腫瘤靶標雙特異性藥物就是一個例子：測定完整的，有活性的雙特異性分子是充分表征該藥物的最佳策略。反之，如果藥物活性依賴于一個靶點的參與，而另一個靶點的參與只是增強了藥物活性, 那么，測定完整藥物可能就不那么重要了；此時，只使用一種藥物特異性試劑 (例如，單臂靶向/1-arm target，單臂/1-arm延長 PK或增加暴露量) 可能是合理的策略。另一種方法的一個例子是評估catumaxomab抗體的PK: 該PK分析方法利用了該抗體藥物是小鼠/大鼠的嵌合結(jié)構(gòu)體，使用了特異性的antispecies immunoglobulin的捕獲/檢測試劑。這里，使用了一個針對藥物的嵌合結(jié)構(gòu)的混合通用分析格式（mixed generic assay format）；該方法特異性來自嵌合結(jié)構(gòu)，而不涉及CDRs。這種方法基于兩個假設(shè): 首先，單克隆抗體(mAb)藥物在體內(nèi)通常非常穩(wěn)定。其次，靶標蛋白沒有可檢測到的可溶性形式。因此，該PK分析方法可以測定血液循環(huán)中游離的catumaxomab單抗，這是符合其預期用途的。一般來說，默認的生物分析策略是利用雙特異性藥物的雙特異性，但需要認識到開發(fā)這樣的試劑是耗時的和有挑戰(zhàn)的；并且可能在藥物發(fā)現(xiàn)甚至非臨床研究階段還沒有這樣的試劑。下面將更詳細地考量各種選擇。

PK定量方法的設(shè)計

完整雙特異性分子的分析方法

 
    完整雙特異性分子定量的目的是測定生物基質(zhì)中完整的雙特異性分子。該測試只測定有活性雙特異性分子，其沒有任何功能區(qū)域被抗藥物抗體(ADA)或血液循環(huán)中的靶點切斷（clipped off）或阻斷（blocked）。完整分子的檢測方法通常需要使用靶標抗體和/或anti-idiotypic抗體，以測定包含可結(jié)合捕獲和檢測試劑這兩個功能域的分子。在評估體內(nèi)或體外穩(wěn)定性時(假設(shè)試劑可用)，建議采用完整分子的分析方法。完整分子定量的測試格式如圖3A所示。

 
     這種測試格式使用兩個靶標分子或兩個完全中和性的anti-idiotypic抗體，或兩者的組合。最近， LC-MS，結(jié)合affinity pull-down（使用靶標或anti-idiotypic抗體）以分離待測物，已用于表征的生物基質(zhì)中的藥物完整分子。Affinity pull-down是一種類似于免疫沉淀（immunoprecipitation）的小規(guī)模親和純化技術(shù)，只是抗體也可以被其它親和系統(tǒng)所取代。

 
     這是一種sequential方法：首先，使用anti-idotypic抗體來下拉（pull down）雙特異性藥物的游離形式；然后，用LC-MS法進行定量。利用這種形式，可以確定雙特異性分子的游離濃度。然而，在方法開發(fā)過程中需要考慮幾個關(guān)鍵因素:

 
     該測試格式必須設(shè)計好，以避免潛在的空間位阻效應(yīng)（steric hindrance）。一些雙特異性分子被設(shè)計為靶向一個可溶性分子和一個與細胞結(jié)合的分子(細胞表面受體)。這種雙特異性分子被明確設(shè)計為與兩個靶點同時相互作用，以發(fā)揮其預期的藥理活性。然而，雙特異性分子和檢測試劑在檢測環(huán)境中可能有不同的相互作用，換句話說，在塑料容器表面可能表現(xiàn)出不同的相互作用。因此，應(yīng)該理解和謹慎的處理空間位阻效應(yīng)。例如，從位阻效應(yīng)研究中收集的數(shù)據(jù)，例如，在Octet平臺上考查域結(jié)合干擾（domain binding interferences）的數(shù)據(jù)，可能指向選擇一個特定的捕獲和檢測順序，以避免不必要的空間位阻效應(yīng);


     一些雙特異性分子，通過協(xié)同作用，具有很高的藥效學效力（highly pharmacologically potent），這可能意味著只需要非常低的臨床劑量。因此, 基于已知的劑量-響應(yīng)數(shù)據(jù)和劑量模型（dose modelling）的分析方法靈敏度將會是一個重要的考量指標;


     與傳統(tǒng)的單特異性抗體相比，雙特異性分子更有可能出現(xiàn)體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化（biotransformation），即體內(nèi)不穩(wěn)定性（in vivo instability）。生物轉(zhuǎn)化不僅可能影響雙特異性分子的活性，而且還可能影響定量雙特異性分子的可靠性。因此，完全中和性，anti-idiotypic抗體或靶標分子(圖3A)有可能允許檢測潛在的生物轉(zhuǎn)化（consequential biotransformation）;

    圖3. 用于定量雙特異性分子的不同測試格式和試劑。(A)完整分子的測定方法：使用靶標蛋白X和靶標蛋白Y作為檢測試劑，測定完整雙特異性分子的濃度。(B) 功能域分析：采用抗Fc抗體和靶標Y蛋白作為檢測試劑來測量功能域Y的濃度。(C)功能域分析：采用抗Fc抗體和X靶標蛋白作為檢測試劑來測量功能域X的濃度。(D)總濃度測定方法：通過使用兩種抗Fc抗體作為測試試劑來測定雙特異性分子的所有可溶形式。

    與單特異性生物藥分子類似，如常規(guī)的單克隆抗體，ADA可以通過阻斷捕獲或檢測試劑與藥物的結(jié)合來干擾對雙特異性分子的定量(注意不要與改變的藥物清除率相混淆)。此外，一個結(jié)構(gòu)域可能是immunodominant；那么取決于測試格式，這可能會導致PK分析結(jié)果的差異。另外，也許除了內(nèi)源性的IgG4分子之外，雙特異性分子所固有的新穎，非天然結(jié)構(gòu)，可能使雙特異性分子比單特異性分子更容易誘發(fā)ADA反應(yīng)，這是免疫原性風險評估的一個考慮因素。


功能域分析（functional domain assay）


     功能域分析是測定一個功能域的濃度，此格式可用于展示相關(guān)的單一功能域的濃度。當雙特異性的MOA使得藥物分子的一部分（a partial molecule）保留部分活性時(如可溶性靶標，融合蛋白，或肽激動劑)，這些檢測顯得尤為重要。功能域分析的目的是確定哪個功能域是有活性的，因此，可用于解釋與ADA的形成或生物轉(zhuǎn)化相關(guān)的功能喪失。


     單域測試格式的設(shè)計如圖3B和3C所示。該方法特意使用藥物靶標，或抑制性anti-idiotypic抗體來分析雙特異性分子的游離結(jié)構(gòu)域（free domain）， 并與抗Fc或抗框架（anti-framework）抗體，作為捕獲或檢測試劑，聯(lián)用。這些分析方法可用于藥物開發(fā)的任何階段。有時，基于細胞的測試方法可以用于測量單個功能域，如blinatumomab情況。


     圖3. 用于定量雙特異性分子的不同測試格式和試劑。(A)完整分子的測定方法：使用靶標蛋白X和靶標蛋白Y作為檢測試劑，測定完整雙特異性分子的濃度。(B) 功能域分析：采用抗Fc抗體和靶標Y蛋白作為檢測試劑來測量功能域Y的濃度。(C)功能域分析：采用抗Fc抗體和X靶標蛋白作為檢測試劑來測量功能域X的濃度。(D)總濃度測定方法：通過使用兩種抗Fc抗體作為測試試劑來測定雙特異性分子的所有可溶形式。



總濃度分析方法（total assay）

 
     總體測定法（total assay）用于測定雙特異性分子的所有可溶形式。這種測試格式可用于顯示雙特異性分子的存在，而不考慮任何結(jié)構(gòu)或功能的變化。該分析方法通常用于測定蛋白質(zhì)的主（骨）干（backbone）結(jié)構(gòu)，如Fc結(jié)構(gòu)域。但這可能并不適用于所有的構(gòu)造；取決于構(gòu)造的性質(zhì)，也不一定適用于所有的分子變構(gòu)體，例如，在臨床研究中rhuMab雙特異性藥物。總體測定法應(yīng)當耐受ADA和與靶標的結(jié)合（target binding）。圖3D描述了總體測定法，其中兩個與不同表位結(jié)合的抗人Fc抗體可以用作捕獲和檢測試劑。


 
    圖3. 用于定量雙特異性分子的不同測試格式和試劑。(A)完整分子的測定方法：使用靶標蛋白X和靶標蛋白Y作為檢測試劑，測定完整雙特異性分子的濃度。(B) 功能域分析：采用抗Fc抗體和靶標Y蛋白作為檢測試劑來測量功能域Y的濃度。(C)功能域分析：采用抗Fc抗體和X靶標蛋白作為檢測試劑來測量功能域X的濃度。(D)總濃度測定方法：通過使用兩種抗Fc抗體作為測試試劑來測定雙特異性分子的所有可溶形式。




    同樣，單一多克隆抗人IgG試劑也可用作捕獲和檢測試劑。但此方法只用于非臨床研究。對于測量總體藥物濃度， LC-MS非常有用，特別是當沒有特定的試劑可用時。總體測定法可與“完整intact”或“有效active”藥物測定法，結(jié)合使用，或同時使用兩者，以評估體內(nèi)外（in vivo /ex vivo）的穩(wěn)定性，以及生物轉(zhuǎn)化（biotransformation）對結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的影響，例如，某些deamidation或氧化反應(yīng)可能破壞藥物與靶標的結(jié)合。

 
   PK樣本中生物環(huán)境的復雜性為使用哪一種定量方法增加了另一層挑戰(zhàn)。生物分析方法的應(yīng)用是從藥物發(fā)現(xiàn)和臨床前安全性評估期間的動物研究開始的，持續(xù)到臨床開發(fā)，并延伸到上市后的生命周期管理(即附加適應(yīng)癥和/或組合療法)。正如前面所指出的，不同的分析策略可以在不同的開發(fā)階段使用；當體內(nèi)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系確立之后，可以在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的整個過程中開發(fā)和使用單一的定量分析方法。但是，需要對分析方法的生命周期管理有特殊考慮，以便將來自多個物種和不同目標患者群體的PK/PD知識整合到所探索適應(yīng)癥中去。

雙特異性分子的方法驗證和認證（method validation & qualification）


    對雙特異性分子的方法驗證和認證與其他大分子一樣，包括精密度和準確度，稀釋線性度，選擇性，干擾和特異性，以及穩(wěn)定性測試，以確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)健性和完整性。然而，由于雙特異性分子的性質(zhì)，如上所述，在開發(fā)完整分子的分析方法時，對這兩個結(jié)構(gòu)域的特異性和分析干擾的評估都是必要的。

特別聲明

    本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請讀者評論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經(jīng)發(fā)表學術(shù)期刊, 官方網(wǎng)絡(luò)報道, 等公開渠道, 不涉及任何保密信息。參考文獻的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價值的文獻及其評估。

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