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昨天（7月8日），由前途匯主辦的新藥技術(shù)MAH交易與創(chuàng)新投融資博覽會在成都溫江皇冠假日酒店隆重舉行。博濟(jì)醫(yī)藥藥物研究中心化藥研究部副總監(jiān)徐洪昌攜團(tuán)隊(duì)重磅亮相此次盛會，并在非常規(guī)制劑平臺合作會場發(fā)表主題演講。在本次活動的展區(qū)內(nèi)，博濟(jì)醫(yī)藥的展位頗為引人注目。工作人員向客商詳細(xì)介紹了博濟(jì)醫(yī)藥及旗下各個(gè)子公司板塊不同的業(yè)務(wù)內(nèi)容，使其對博濟(jì)醫(yī)藥的業(yè)務(wù)范圍與核心實(shí)力有了更深的了解，為后續(xù)溝通合作打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。博濟(jì)醫(yī)藥展位區(qū)受參展客商青睞作為博濟(jì)醫(yī)藥在本次大會的重要活動之一，藥物研究中心化藥研究部副總監(jiān)徐洪昌在非常規(guī)制劑平臺合作會場上發(fā)表名為《國內(nèi)藥品市場的未來發(fā)展趨勢及項(xiàng)目推廣》的主題演講。演講伊始，徐洪昌分別從人群比例、適應(yīng)癥分布、政策調(diào)控與未來發(fā)展趨勢推測四個(gè)方面闡述了當(dāng)前國內(nèi)化學(xué)藥品的現(xiàn)狀，并結(jié)合博濟(jì)醫(yī)藥多個(gè)具有代表性的創(chuàng)新藥研發(fā)案例，與在場來賓分享了創(chuàng)新藥研發(fā)的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。在演講尾聲，徐洪昌將博濟(jì)醫(yī)藥部分自主研發(fā)并已獲得階段性成果的藥品創(chuàng)新項(xiàng)目向與會者作了展示，并歡迎各界同仁前來洽談技術(shù)合作或項(xiàng)目轉(zhuǎn)讓事宜。

今日（6月23日）晚，博濟(jì)醫(yī)藥對外發(fā)布《向特定對象發(fā)行股票發(fā)行情況報(bào)告書》（下稱《報(bào)告書》），確定公司向特定對象發(fā)行股票事項(xiàng)發(fā)行完畢。廣州高新區(qū)投資集團(tuán)獲配股數(shù)最多，認(rèn)購金額近9000萬元。《報(bào)告書》顯示，本次發(fā)行價(jià)為10.26元/股，發(fā)行股數(shù)3345.06萬股，募集資金3.43億元，發(fā)行對象為12家。其中廣州高新區(qū)投資集團(tuán)獲配股數(shù)最多，認(rèn)購金額近9000萬元。博濟(jì)醫(yī)藥相關(guān)負(fù)責(zé)人表示，本次募集資金扣除發(fā)行費(fèi)用后將用于合同研發(fā)生產(chǎn)組織（CDMO）平臺建設(shè)項(xiàng)目、創(chuàng)新藥研發(fā)服務(wù)平臺建設(shè)項(xiàng)目、臨床研究服務(wù)網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)建與能力提升項(xiàng)目以及補(bǔ)充流動資金。

本文為系列文章《大分子生物分析概論》的第九篇，旨在根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)資料，介紹大分子生物分析中對關(guān)鍵試劑的管理。由于內(nèi)容篇幅較長，本文將采取上下篇形式進(jìn)行推送，敬請垂注！《袁來如此》專欄系廣州博濟(jì)醫(yī)藥微信公眾號打造的科普學(xué)術(shù)專欄，內(nèi)容均為博濟(jì)醫(yī)藥子公司深圳博瑞副總經(jīng)理袁智博士原創(chuàng)。1.導(dǎo)論配體結(jié)合式測試方法（ligand binding assays, LBA）廣泛地用于測定生物藥在動物和人體體液中的濃度，從而評估其藥代動力學(xué)、免疫原性以及與疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物。是而這些測試方法的基礎(chǔ)則是試劑，LBA方法的特異性、選擇性和靈敏度都取決于這些試劑。受藥物的應(yīng)用、開發(fā)階段、業(yè)務(wù)和資源的影響和限制，LBA試劑的多樣性及其應(yīng)用，演進(jìn)出多樣化的管理方法。例如，非臨床毒理學(xué)（TK）和臨床藥代動力學(xué)（clinical PK）的分析任務(wù)可能類似；但對用于臨床檢測方法，隨著新藥項(xiàng)目通過臨床開發(fā)的不同階段，需要對試劑的多個(gè)批次變化及其長期存儲的穩(wěn)定性進(jìn)行管理。雖然沒有一個(gè)適合所有狀況的應(yīng)對方法，管理試劑生命周期的努力往往分為兩類：（1）對大量使用的某一個(gè)批次的試劑，其存儲穩(wěn)定性和物流將是主要問題；（2）如果使用小批次，批次更改的管理將是主要問題。業(yè)內(nèi)已然認(rèn)識到，某些試劑至關(guān)重要，其變化會顯著地改變或削弱使用它們的測試方法的性能。對關(guān)鍵試劑的控制是保證LBA測試方法的質(zhì)量和效能長期一致的基礎(chǔ)。盡管目前的監(jiān)管指南為PK和免疫原性測試方法的驗(yàn)證提供了非常具體的指導(dǎo)，但一般沒有就關(guān)鍵試劑的生命周期的許多方面提供足夠的指導(dǎo)，包括試劑的穩(wěn)定性。美國FDA和歐洲藥品管理局（EMA）發(fā)布的生物分析方法的指南只是提供了一些與關(guān)鍵試劑相關(guān)的關(guān)注點(diǎn)。在日本，關(guān)于LBA的指南草案現(xiàn)已公開審議。巴西、中國和印度則沒有任何相關(guān)指南。已發(fā)布的指導(dǎo)文件和白皮書對關(guān)鍵試劑的管理大多只是泛泛而談，在如何管理不斷變化的關(guān)鍵試劑方面缺乏通用的實(shí)際操作指南：包括重要和次要批次更改、文檔記錄、測試試劑的穩(wěn)定性及其性能標(biāo)準(zhǔn)和批次間的連續(xù)性。因此，整個(gè)行業(yè)需要一個(gè)統(tǒng)一的方法，以提高一致性，并基于健全的科學(xué)和監(jiān)管原則作出相關(guān)決策。經(jīng)過研究有關(guān)LBA關(guān)鍵試劑的全球指南和文獻(xiàn)，本文總結(jié)出如下共識和最佳做法供討論和實(shí)施：根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和研究已發(fā)表的文獻(xiàn)，試劑需要在測試方法的生命周期的背景下加以考慮和管理。特別是，對一個(gè)關(guān)鍵試劑的表征，對于最初選擇該試劑和在該測試方法的整個(gè)生命周期內(nèi)有效地供應(yīng)這個(gè)關(guān)鍵試劑，非常重要。以下主要關(guān)注四個(gè)方面：? 關(guān)鍵試劑的記錄文檔? 內(nèi)部關(guān)鍵試劑與商用試劑的異同? 關(guān)鍵試劑的更換? 關(guān)鍵試劑的穩(wěn)定性。本文不打算考慮的議題包括參比試劑（reference standards）和內(nèi)標(biāo)（internal standards），基于細(xì)胞的PK測試方法和抗藥物抗體（ADA）檢測所需的樣本基質(zhì)以外的基質(zhì)。總體而言，對于關(guān)鍵試劑管理存在著多種做法的結(jié)論，在某些領(lǐng)域形成了高度共識。值得一提的是，相關(guān)調(diào)查結(jié)果表明，有關(guān)文檔記錄的監(jiān)管指南有不一致之處，特別是對于批次變更，只有約 50% 的法規(guī)指南具有解決批次變更的程序。大多數(shù)被調(diào)查者表示擁有關(guān)鍵試劑的生產(chǎn)程序，但沒有過期后有效期再延長的程序。2.建議和最佳做法關(guān)鍵試劑的定義雖然在某些情況下，測試方法的任何組成成分對其性能都可能至關(guān)重要，但對任何特定測試方法的關(guān)鍵試劑都需要產(chǎn)生一個(gè)準(zhǔn)確定義。難以生產(chǎn)、替換、獲取或取代的試劑可被視為稀有關(guān)鍵試劑；相反，更通用的試劑，如抗輕鏈或重鏈抗體，在某些檢測中也可能至關(guān)重要。免疫捕獲與LC-MS結(jié)合的測試方法可能需要將捕獲抗體視為關(guān)鍵試劑，即使是測試緩沖液或阻斷試劑也可能對ADA檢測的性能至關(guān)重要。如果需要將某個(gè)試劑定義為關(guān)鍵試劑，就需要主動地管理試劑的可及性和可重復(fù)性，應(yīng)當(dāng)通過制定書面的相關(guān)程序，用以定義某些試劑為關(guān)鍵試劑，并在整個(gè)測試方法的生命周期內(nèi)管理這些試劑。雖然大多數(shù)監(jiān)管機(jī)構(gòu)尚未定義關(guān)鍵試劑，但確實(shí)討論了LBA相關(guān)試劑的關(guān)鍵性質(zhì)。2001年發(fā)布的FDA《生物分析方法驗(yàn)證的行業(yè)指南》中將一些試劑定義為重要和關(guān)鍵（key and critical），并概述了在測試方法的整個(gè)生命周期中管理這些試劑的各個(gè)方面，包括交叉反應(yīng)性（cross-reactivity）、儲存條件的定義、穩(wěn)定性評估以及當(dāng)批次改變時(shí)，評估抗體和標(biāo)記了的被分析物（示蹤劑，tracer）的性能，都表明了這些試劑的關(guān)鍵性質(zhì)和是需要評估的。這些評估的需求可以很容易地?cái)U(kuò)展到其它的LBA試劑。2011年EMA生物分析方法驗(yàn)證指南支持并拓寬了2001年FDA指南中的關(guān)鍵/關(guān)鍵試劑的概念。這些指南認(rèn)識到測試方法的特異性是由所使用的試劑決定的，對關(guān)鍵試劑的控制對于測試方法的質(zhì)量和長期保持其效能是至關(guān)重要的，監(jiān)管機(jī)構(gòu)和一些文獻(xiàn)都提出將某些試劑確定為關(guān)鍵試劑。本文建議定義以下關(guān)鍵試劑：對待測物（analyte）特異性的LBA分析試劑通常被視為關(guān)鍵試劑（抗體，多肽，蛋白質(zhì)，耦合物（標(biāo)記），作為試劑的藥物和ADA試劑（陽性和陰性對照品）。EMA指南將關(guān)鍵試劑定義為"...結(jié)合試劑（binding reagents），例如，結(jié)合蛋白、aptamer、抗體或耦合后的抗體）和那些含有酶活性域，對測定結(jié)果有直接影響的試劑......"。生物分析界同意并擴(kuò)大這一定義，以包括多肽，如受體或配體及它們的片段。監(jiān)管指南非常明確地說明了，對于PK標(biāo)準(zhǔn)品（PK reference standards），需要如何作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行控制和評估。然而，PK標(biāo)準(zhǔn)品也可以成為一個(gè)關(guān)鍵的試劑，無論是在免疫原性還是靶標(biāo)生物標(biāo)志物的檢測中（通常是在耦合后）。生物標(biāo)志物的校準(zhǔn)物（Biomarker calibrators）通常遠(yuǎn)不如藥物標(biāo)準(zhǔn)品（drug reference standards）的表征充分。因此，批次變化更難于控制，而且往往得不到來自認(rèn)可源頭（例如，US Pharmacopeial Convention）的校準(zhǔn)物。雖然生物標(biāo)志物校準(zhǔn)物不在本文討論的范圍內(nèi)，但可以總結(jié)性地指出，關(guān)于生物標(biāo)志物校準(zhǔn)物的具體指南通常都缺乏，因而在預(yù)期做法與實(shí)際操作之間存在很大差距。3.關(guān)鍵實(shí)際的表征（Characterization）和認(rèn)證（Qualification）關(guān)鍵試劑的質(zhì)量是穩(wěn)健地開發(fā)測試方法所必須的基本組成部分。測試試劑是根據(jù)它們對待測物（the analyte of interest）的特異性和樣本基質(zhì)以及其它試劑的交叉反應(yīng)特性而開發(fā)和選擇的。在方法開發(fā)之前和期間，可以通過多種方式測試這些試劑的特異性和交叉反應(yīng)性。理解選擇這些試劑的方式、原因以及性能，對于選擇和認(rèn)證新批次的試劑（如果需要的話）是非常重要的。臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所的指南強(qiáng)調(diào)需要對試劑進(jìn)行表征，并提供了關(guān)鍵特性的指導(dǎo)。一旦測試方法開發(fā)完成并確定了關(guān)鍵試劑，就可以定義重新供應(yīng)（resupply）關(guān)鍵試劑的風(fēng)險(xiǎn)。例如考慮復(fù)雜的免疫策略。對于商業(yè)來源的試劑，稀缺性（rarity）是主要挑戰(zhàn)（例如，單一供應(yīng)商/供貨商，細(xì)胞株的可及性）；對于內(nèi)部試劑，純化和耦聯(lián)的復(fù)雜性或是挑戰(zhàn)可能。監(jiān)管指南指出，關(guān)鍵試劑的表征和認(rèn)證應(yīng)針對預(yù)設(shè)的用途，但是所需要的試劑表征的程度，對給定的測試方法而言，差別可能很大。因此，本文不詳描述試劑表征和初始認(rèn)證的評估范圍，而是僅僅建議：進(jìn)行足夠的表征，以便在生成新批次時(shí)，實(shí)現(xiàn)某種形式的一致性（consistency）和過程控制（process control），并且這種認(rèn)證是有據(jù)可查的。試劑特征包括但不限于：身份(identity)、來源、純度、濃度（或滴度）、結(jié)合親和力（bindingaffinity）、等型（單克隆/多克隆抗體）、分子量、特異性（specificity）、成合比（incorporation ratio）和聚合程度(aggregation level)。若干文獻(xiàn)詳細(xì)討論了關(guān)鍵的試劑表征和測試方法，藥物開發(fā)的階段也是投資試劑表征的程度和范圍的考慮因素之一。4.關(guān)鍵試劑的采購考慮獲得足夠數(shù)量的關(guān)鍵試劑，無論是內(nèi)部制備的，或是從商業(yè)來源采購的，最好是能夠滿足整個(gè)臨床研究的需要。試劑可以在內(nèi)部生產(chǎn)，也可以作為定制生產(chǎn)或現(xiàn)成的試劑從商業(yè)來源獲得。然而，選擇關(guān)鍵試劑的可靠來源，這個(gè)看起來顯然很簡單的任務(wù)，卻并非易事。這可能需要仔細(xì)規(guī)劃、考慮利弊以及進(jìn)行盡職調(diào)查。內(nèi)部生產(chǎn)試劑可獲得內(nèi)部定制生產(chǎn)的試劑，以適應(yīng)所設(shè)計(jì)的測試方法; 可以對其預(yù)設(shè)的用途，進(jìn)行大范圍表征，可以自定義分析證書（CofA），產(chǎn)生穩(wěn)定性數(shù)據(jù)等。更重要的是，可以監(jiān)測和控制批次間的變異性（特別是在標(biāo)記蛋白質(zhì)時(shí)）。此外，對內(nèi)部生產(chǎn)的試劑的管控，可能允許更好地進(jìn)行生命周期管理。然而，內(nèi)部生產(chǎn)試劑需要熟練的人員以及大量的投資，以建立一個(gè)試劑生產(chǎn)的基礎(chǔ)設(shè)施和預(yù)先規(guī)劃的生產(chǎn)過程。商業(yè)生產(chǎn)的試劑商用試劑廣泛地用于各種格式的LBA的開發(fā)。商業(yè)試劑的主要優(yōu)勢包括：可以從多個(gè)供應(yīng)商處立即獲得各種試劑，通常對預(yù)設(shè)用途做過表征并附帶有某種 CofA。此外，可以從多個(gè)來源獲得各種檢測試劑（標(biāo)記過的蛋白），并在其中找到，對某個(gè)特定測定方法而言，性能卓越的檢測試劑。除了現(xiàn)成的試劑外，許多供應(yīng)商還提供定制生產(chǎn)和特定試劑的表征。這種方式的主要好處是：信譽(yù)良好的測試試劑的制造商通常擁有完善的生產(chǎn)設(shè)施，技術(shù)能力和知識儲備，可以有效地支持試劑的生產(chǎn)和應(yīng)用。此外，它們還可以為最終用戶提供出色的支持，包括定制試劑的生成和耦合以及解決應(yīng)用中出現(xiàn)的問題。然而，使用商業(yè)試劑并非沒有挑戰(zhàn)。有幾個(gè)與商業(yè)試劑有關(guān)的問題，可能需要仔細(xì)考慮。其中一些列在表1中，包括缺少試劑的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)、缺少可用的試劑規(guī)格/批次放行的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)（盡管某些供應(yīng)商可能會應(yīng)客戶的要求提供該標(biāo)準(zhǔn)）以及缺乏相關(guān)試劑的其他基本信息。最大的挑戰(zhàn)是未標(biāo)記和標(biāo)記的試劑批次之間的變異性。在使用多個(gè)批次試劑的長期研究中，這可能會造成橋接數(shù)據(jù)的困難。生產(chǎn)商改變關(guān)鍵試劑的批次并不罕見，例如用于生產(chǎn)偶聯(lián)體的多克隆抗體池，它們可能符合批次放行的規(guī)范，但可能對最終用戶構(gòu)成重大風(fēng)險(xiǎn)。此類變更很可能無法及時(shí)傳達(dá)給最終用戶。此外，特定試劑的生產(chǎn)可能會終止，并且不會提前通知客戶。關(guān)于關(guān)鍵試劑采購的建議鑒于商業(yè)試劑來源于能力（雄厚的技術(shù)，支持性文件的實(shí)力，有提供多批次產(chǎn)品的能力）各不相同的多個(gè)供應(yīng)商，謹(jǐn)慎的做法是進(jìn)行盡職調(diào)查和可行性評估，以選擇可靠的試劑和供應(yīng)商。無論試劑是在內(nèi)部生產(chǎn)還是從商業(yè)來源獲取，了解試劑具體特征的需求都是一樣的。與供應(yīng)商建立密切關(guān)系是非常有益的，這有助于擴(kuò)展技術(shù)支持的范圍，以提高故障排除率，解決試劑相關(guān)問題，及時(shí)獲取有關(guān)試劑批次變化的信息和確保特定批次的長期供應(yīng)。此外，如果只有一家關(guān)鍵試劑的供應(yīng)商，則建議考慮建立某種合同關(guān)系，這些合同關(guān)系可以給用戶預(yù)警產(chǎn)品更改或生產(chǎn)停止。下面列出了值得考慮的若干的要點(diǎn)：& 來自不同供應(yīng)商的相同濃度單位的重組蛋白和多肽在一個(gè)測試系統(tǒng)中可能有不同的表現(xiàn)。因此，選擇并保留足夠數(shù)量的試劑以滿足長期需要是有益的。在某些情況下，如果已在驗(yàn)證期間確定一個(gè)校正因子，或者已生成能支持該校正因子的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，則可考慮使用校正系數(shù)來補(bǔ)償內(nèi)容和比例錯(cuò)誤（content and proportional errors）。& 供應(yīng)商通常擁有質(zhì)量控制/質(zhì)量保證和批次放行的流程。盡管通常不能審核這些流程，但在某些情況下，可能有機(jī)會對供應(yīng)商的設(shè)施進(jìn)行QA審計(jì)。& 通常可以通過提出特定請求可以獲得通常不伴隨著試劑提供的文件（例如，與試劑的表征，穩(wěn)定性，批次放行規(guī)范，等，相關(guān)的文件）。& 商業(yè)化生產(chǎn)的預(yù)涂層固相支持物件，如電化學(xué)發(fā)光和ELISA板材和珠子可能需要被視為關(guān)鍵試劑。應(yīng)該建立和記錄與這些關(guān)鍵試劑相關(guān)的內(nèi)部流程，如批次驗(yàn)收測試，以確保板材的涂層均勻，尤其是在使用條帶的情況下。對于使用商業(yè)試劑構(gòu)建的內(nèi)部生物標(biāo)志物的檢測方法，應(yīng)使用含有內(nèi)源性被分析物（endogenous analyte）的混合（pooled）生物基質(zhì)（如血清/血漿）作為QCs，用來監(jiān)測不同批次的商業(yè)試劑的性能。& 解釋生產(chǎn)商的失效期數(shù)據(jù)，作為該試劑的測試/再測試的依據(jù)，因?yàn)樵撛噭┰诔^"到期日期"后，可能仍適用于預(yù)期用途。請參閱“試劑穩(wěn)定性”部分，以得到相關(guān)的詳細(xì)指導(dǎo)。表1.從內(nèi)部和商業(yè)來源獲得的試劑的有關(guān)注意事項(xiàng)5.關(guān)鍵試劑的更換用于配體結(jié)合測試方法的試劑通常由生物生產(chǎn)過程生產(chǎn)，而不是一個(gè)完全可控的合成過程。這將導(dǎo)致不同批次之間的可變性和異質(zhì)性。蛋白生產(chǎn)出來之后，通常有純化和標(biāo)記步驟，這更增加了產(chǎn)品的復(fù)雜性。此外，通常需要在很長的一段時(shí)間里，使用這些測試方法，以支持一個(gè)藥物的整個(gè)生命周期，這意味著可能需要多個(gè)批次的試劑來支持長期的測試。為了盡量減少批次之間的可變性，必須擁有規(guī)范良好，并且前后一致的試劑生產(chǎn)流程；也必須按照相關(guān)的生產(chǎn)方案和標(biāo)記程序(labeling procedures)生產(chǎn)，并且完整地記錄整個(gè)流程。但是，方案（protocols）和程序（procedures）的詳細(xì)程度往往不合適（見最近的例子見15）。所以必須認(rèn)識到：對生產(chǎn)程序的描述越詳細(xì)，試劑生產(chǎn)的可重復(fù)性就越大，更換關(guān)鍵試劑可能是面臨的最重大的挑戰(zhàn)之一。在2001年生物分析方法驗(yàn)證指南中，F(xiàn)DA指出“...如果更改關(guān)鍵試劑，則可能需要重新優(yōu)化或驗(yàn)證該測試方法”。此外，EMA指南規(guī)定，當(dāng)試劑批次更改時(shí)，必須確認(rèn)測試方法的分析效能，“以確保與原始批次或上一批次的試劑相比，該方法的效能不會改變”。對試劑的任何操作都代表該試劑成為一個(gè)新的批次（包括稀釋）。OHara等人將試劑或某個(gè)批次試劑的更改歸類為需要不同評估的級別：即主要和次要的更改。這樣的評估是由科學(xué)驅(qū)動。建議事先確定一套明確的績效評估方法和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，并詳細(xì)記錄驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)。相關(guān)文件可以是指導(dǎo)試劑更改的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP），也可以作為最終方法報(bào)告的一部分。事實(shí)上，并非所有生物分析實(shí)驗(yàn)室都有相應(yīng)的程序或者正式的SOP，用以管理試劑批次的變更。在某些情況下，認(rèn)證可能只是使用新試劑批次的單個(gè)測試運(yùn)行，或者在同一運(yùn)行中使用新和舊試劑的單個(gè)測試運(yùn)行。與舊批次比較是有用的，但不是絕對需要的，因?yàn)樵谠S多情況下，舊（或原始）批次可能已經(jīng)用完。某些實(shí)驗(yàn)室擁有定義更明確的、用于批次變更的測試方法驗(yàn)證程序。在某些情況下，對新試劑的定義也可能存在一些差異，例如從同一原始材料生產(chǎn)出來的新批次。業(yè)界最初認(rèn)為，新批次試劑的認(rèn)證和穩(wěn)定性測試的接受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括最大的儀器響應(yīng)。然而，對基于儀器響應(yīng)的信號控制圖（signal control charts）的效用有不同意見。因此，需要關(guān)注下列事項(xiàng)：用于生成檢測信號的分析平臺；比較同一儀器隨時(shí)間而獲取的信號的能力；比較不同儀器的所產(chǎn)生的信號的能力以及環(huán)境溫度等變量的影響。關(guān)于更換關(guān)鍵試劑的建議本文建議在一個(gè)功能性測試中測試新試劑，并采用預(yù)先驗(yàn)設(shè)立的檢測驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。下面提出了認(rèn)證這些關(guān)鍵試劑的兩級式方法，測試的范圍是由該試劑的變化程度，或者這些變化可能產(chǎn)生的影響程度所驅(qū)動的。在測試中，通常使用外加待測物的QCs來定義該方法的效能，但對于生物標(biāo)志物的測定，可能需要包括含有內(nèi)源性待測物（endogenousanalyte）的，基于真實(shí)樣本的QCs，以確保commutability（可變性）。細(xì)微變化試劑的細(xì)微變化被定義為預(yù)期對測試性能影響極小的試劑改變；因此可以實(shí)施相關(guān)改變，而不會對數(shù)據(jù)生成產(chǎn)生任何有害影響。這種細(xì)微變化的例子是一個(gè)從以前認(rèn)證過的原液發(fā)展而來新的試劑批次，如：從相同動物的多克隆血清做的新一次親和純化的產(chǎn)品；或使用相同批次的蛋白質(zhì)做的新一次耦合反應(yīng)，而該耦合過程已經(jīng)被證明是受控良好的。用于制備新一個(gè)試劑批次的過程應(yīng)與用于生成原始批次的過程相同。第一個(gè)測試級別包含所有試劑的資格認(rèn)證計(jì)劃中所共有的測試（圖1）。& 推薦測試運(yùn)行一次，包括3個(gè)級別的QC樣品，但更理想的是包括定量下限和上限在內(nèi)的，總共5個(gè)QC，因?yàn)槎糠秶膬蓚€(gè)極端是PK和生物標(biāo)志物測試方法最脆弱的地方。對于免疫原性測試，應(yīng)包括3個(gè)級別的QC樣品，包括接近切點(diǎn)的陰性和低陽性對照樣品。& 如果同時(shí)更換多個(gè)試劑，則可以使用同一檢測方法一起測試并認(rèn)證這些試劑。建議執(zhí)行多個(gè)測試運(yùn)行，以提高對結(jié)果的信心，并且最大程度地降低接受假陽/陰性結(jié)果而導(dǎo)致的風(fēng)險(xiǎn)。但是，如果一次只更換一個(gè)試劑，則一次運(yùn)行可能就足夠了。& 建議在可能的情況下，并行地測試當(dāng)前試劑與原始試劑。與原始批次的比較在監(jiān)視或控制測定方法性能的漂移方面非常有用。但是，在沒有可比較批次的情況下，對最大信號和/或 QC信號的監(jiān)控就變得更加重要了。& 一旦從適當(dāng)?shù)恼J(rèn)證測試生成了可接受的數(shù)據(jù)，其結(jié)果應(yīng)作為能夠接受試劑更換的記錄，無需再做進(jìn)一步認(rèn)證。& 在結(jié)果不符合接受標(biāo)準(zhǔn)的情況下，可能需要進(jìn)一步單獨(dú)測試以確定失敗的原因。單次失敗可以通過重新制備一次標(biāo)準(zhǔn)樣品和QCs，并重新測試來補(bǔ)救。然而，反復(fù)的失敗至少會表明需要制備一個(gè)新試劑批次，并可能重新優(yōu)化該測試方法。反復(fù)的失敗也可能表明需要生產(chǎn)一批新的原始試劑；但這將被視為一個(gè)重大變更。& 建議監(jiān)控QC樣品的最大儀器響應(yīng)，但僅僅作為判斷測試方法性能的一個(gè)工具，而不是作為接受標(biāo)準(zhǔn)。隨著在較長持續(xù)時(shí)間內(nèi)或較大研究中收集，整理更多的數(shù)據(jù)，跟蹤QC最大儀器響應(yīng)趨勢的價(jià)值會隨之增加。重大變更這是最高的試劑認(rèn)證級別，主要適用于在一個(gè)試劑的原始來源枯絕，需要更換關(guān)鍵試劑的情況。此時(shí)，將確定新的供應(yīng)商，表征新的試劑，并證明新試劑的測試性能。重大變化的例子包括從新動物獲得的抗體批次、用于單克隆抗體生產(chǎn)的新克隆，或用于生產(chǎn)重組物料的新細(xì)胞系。其中每個(gè)變更都預(yù)期需要廣泛的重新認(rèn)證。為了維持測試方法的性能，一個(gè)不太明顯，但有時(shí)是必不可少的任務(wù)，可能是采用一個(gè)新批次的陰性對照品，這對于免疫原性測試的關(guān)系特別重大。除采納對試劑細(xì)微變更時(shí)的認(rèn)證建議外，對測試試劑的重大變更也應(yīng)考慮采取以下行動（圖1）：& 應(yīng)至少執(zhí)行三次測試運(yùn)行，以表征新試劑的測試性能。& 在多次運(yùn)行中，并行測試新試劑和原始試劑。如果新試劑不符合測試接受標(biāo)準(zhǔn)和/或其測試性能發(fā)生變化，但試劑仍然適合用于測試目的，則新試劑可能是可以接受的，但需要更廣泛的認(rèn)證，如部分方法驗(yàn)證。& 還需要其他數(shù)據(jù)來描述和正確記錄新試劑對測試方法參數(shù)的全面影響。圖1.關(guān)鍵試劑管理流程的總結(jié) 10.特別聲明本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請讀者評論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經(jīng)發(fā)表學(xué)術(shù)期刊, 官方網(wǎng)絡(luò)報(bào)道, 等公開渠道, 不涉及任何保密信息。參考文獻(xiàn)的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價(jià)值的文獻(xiàn)及其評估。參 考 文 獻(xiàn)1. King, L, et al., Ligandbinding assay critical reagents and their stability: recommendations and bestpractices from the Global Bioanalysis Consortium Harmonization Team. The AAPSjournal, 2014. 16(3): p. 504-15.2. DeSilva B, et al. Recommendationsfor the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to supportpharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 2003;20(11):1885–900.3. Mire-Sluis AR, et al.Recommendations for the design and optimization of immunoassays used in thedetection of host antibodies against biotechnology products. J Immunol Methods.2004;289(1–2):1–16.4. Nowatzke W, Woolf E. Bestpractices during bioanalytical method validation for the characterization ofassay reagents and the evaluation of analyte stability in assay standards,quality controls, and study samples. AAPS J. 2007;9(2):E117–22.5. Rup B, O’Hara D. Criticalligand binding reagent preparation/selection: when specificity depends onreagents. AAPS J. 2007;9(1):E148–55.6. Staack RF, et al. Quality requirements for critical assayreagents used in bioanalysis of therapeutic proteins: what bioanalysts shouldknow about their reagents. Bioanalysis. 2011;3(5):523–34. doi:10.4155/bio.11.16.7.O’Hara DM, et al. Ligand binding assays in the 21st century laboratory:recommendations for characterization and supply of critical reagents. AAPS J.2012;14(2):316–28. doi:10.1208/s12248-012-9334-9.8.Miller WG, et al. Commutability limitations influence qualitycontrol results with different reagent lots. Clin Chem. 2011;57(1):76–83.9.Clinical LaboratoryStandards Institute (Formerly NCCLS). Assessing the quality of immunoassaysystems: radioimmunoassays and enzyme, fluorescence, and luminescenceimmunoassays; approved guideline. NCCLS I/LA23-A 2004;24 (16).10.Geist BJ, et al.Characterization of critical reagents in ligand-binding assays: enabling robustbioanalytical methods and lifecycle management. Bioanalysis. 2013;5(2):227–44.doi:10.4155/bio.12.304.11.Kirkwood TB. 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Biologicals.2009;37(6):369–78.17.Viswanathan et al.Workshop/conference report—quantitative bioanalytical methods validation andimplementation: best practices for chromatographic and ligand binding assays.AAPS J. 2007;9(1):E30–42.

上周，“袁來如此”專欄初步介紹了LBA中的質(zhì)量控制樣品（QC，quality control）制備、認(rèn)證（qualification）和批次一致性維護(hù)的相關(guān)概念和實(shí)踐方法（袁來如此｜大分子生物分析概論（八_上）：LBA方法質(zhì)量控制樣品的制備和認(rèn)證）。本期將延續(xù)上期內(nèi)容，重點(diǎn)就監(jiān)管機(jī)構(gòu)對QC的要求、跟蹤QC的效能趨勢、防止分析漂移等方面做了詳細(xì)解讀。“袁來如此”專欄系廣州博濟(jì)醫(yī)藥微信公眾號打造的科普學(xué)術(shù)專欄，內(nèi)容均為博濟(jì)醫(yī)藥子公司深圳博瑞副總經(jīng)理袁智博士原創(chuàng)。監(jiān)管機(jī)構(gòu)對于QC的態(tài)度LBA測試中的QC樣品，應(yīng)通過在合格（qualified）的基質(zhì)中加入已知濃度的參考（比）標(biāo)準(zhǔn)品（用于PK定量分析），或稀釋/濃縮的含有陽性對照抗體的原液（用于ADA測試）來制備。關(guān)于QC樣品的組成、目標(biāo)值和接受標(biāo)準(zhǔn)的通用指南，已由下述監(jiān)管機(jī)構(gòu)發(fā)布：美國FDA，歐洲藥監(jiān)局(EMA)，日本衛(wèi)生部，勞動和福利(MHLW)和巴西衛(wèi)生監(jiān)察局(ANVISA)。表3總結(jié)了監(jiān)管機(jī)構(gòu)對于定量（PK）分析中所使用的QCs的制備和組成的要求。表3.監(jiān)管機(jī)構(gòu)對用于定量分析QC的要求之比較。& 應(yīng)按照確立的方法制備QCs。& 對于LBA定量方法，如PK分析，最少需要QC低、中、高三個(gè)濃度水平。高濃度QC的濃度大約是定量上限（ULOQ）的75%，中濃度QC的點(diǎn)相當(dāng)于定量范圍的幾何中心（geometric center，定量下限和定量上限的中心點(diǎn)），低濃度QC是定量下限（LLOQ）的三倍或更低的濃度。QC濃度點(diǎn)應(yīng)該包含在高濃度及低濃度校準(zhǔn)點(diǎn)（calibrators）之間，否則即使?jié)M足%CV和%RE也不能接受。&對于LBA定性分析，如ADA測試，需要高濃度和低濃度陽性對照（HPC和LPC）；中濃度的QC通常包含在研究前驗(yàn)證中，但在真實(shí)樣本分析過程中是可以不用的。相關(guān)指南文件中沒有提供關(guān)于HPC外加濃度的具體要求。對于LPC的指導(dǎo)建議是，在所制備QC的濃度水平中，有大致1%的失敗率。這意味著每100個(gè)LPC中有1個(gè)預(yù)計(jì)會落在篩選微孔板的切點(diǎn)之外。& 所有QC應(yīng)當(dāng)按照研究樣本的預(yù)期存儲條件和已驗(yàn)證的分析測試方法，以一次性使用的分裝方式保存?zhèn)溆谩２粚儆诒O(jiān)管機(jī)構(gòu)要求，但同樣是良好做法的其它建議包括:& 制備足夠數(shù)量的QC樣品，以支持方法驗(yàn)證、短期和長期穩(wěn)定性研究以及至少一項(xiàng)生物樣本分析研究。& 可以制備大量的QC，以達(dá)到可使用數(shù)年的數(shù)量。如果已經(jīng)進(jìn)行了或正在進(jìn)行的研究（能在報(bào)告研究樣本的分析結(jié)果之前提供相關(guān)穩(wěn)定性數(shù)據(jù)）表明穩(wěn)定性評價(jià)覆蓋了整個(gè)存儲窗口期。跟蹤QC的效能趨勢2011年，美國FDA發(fā)布的《生產(chǎn)過程驗(yàn)證指南》介紹了制藥過程生命周期管理的概念并建議：一旦建立和驗(yàn)證了每個(gè)過程的性能規(guī)范（performance specifications），就要對這些過程的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。Sondag和Schofield建議也將檢測/分析方法納入生命周期管理，分析實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)制定分析趨勢的內(nèi)部指南。這些指導(dǎo)方針應(yīng)預(yù)先確立，以防止研究過程中出現(xiàn)的問題。在理想情況下，趨勢研究應(yīng)在研究前驗(yàn)證時(shí)開始或者不遲于第一次生物樣本分析。2018年FDA的生物分析指南已經(jīng)解決了對QC樣品性能的監(jiān)控以及對任何漂移潛在原因的評估。盡管FDA沒有提供如何進(jìn)行監(jiān)測的準(zhǔn)則，但值得注意的是，F(xiàn)DA提供了用于CLIA的趨勢跟蹤方法，在某種程度上該方法也適用于LBA。因?yàn)镃LIA要求多名分析人員，在多天內(nèi)，多次運(yùn)行不同的QC組合（QC sets）。QC趨勢可以是實(shí)時(shí)的，也可以是間接的（Scherder和Giacoletti討論了兩種方法的區(qū)別），大多數(shù)SPC工具的設(shè)計(jì)目標(biāo)是盡早發(fā)現(xiàn)QC的漂移（shifts），以便制定和實(shí)施適當(dāng)?shù)募m正措施。統(tǒng)計(jì)過程控制統(tǒng)計(jì)過程控制（Statistical Process Control，SPC）是一種評估QC趨勢的方法論，用于確保一個(gè)系統(tǒng)按預(yù)期持續(xù)運(yùn)行。SPC分析的兩個(gè)主要目標(biāo)是：(a)確認(rèn)過程處于統(tǒng)計(jì)控制狀態(tài)；(b)度量其產(chǎn)生符合特定規(guī)范結(jié)果的能力。SPC推薦以下步驟:1.使用初始QC數(shù)據(jù)（如n=30）計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)；2.使用平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差建立質(zhì)量控制界限（QC limits）；3.建立所有其它QC規(guī)則（QC rules）；4.使用質(zhì)量控制圖表和建立的質(zhì)量控制規(guī)則來監(jiān)控過程中的趨勢。如果一個(gè)過程或方法能夠預(yù)測未來的結(jié)果，那么它就處于統(tǒng)計(jì)控制狀態(tài)。這意味著必須理解該過程中的每一個(gè)變異性的來源。質(zhì)量控制圖表用于監(jiān)控過程中的意外變化和漂移/位移(表現(xiàn)為系統(tǒng)性偏差)，控制圖表有助于識別有害的分析測試事件，如果能夠建立異常結(jié)果與方法參數(shù)改變（如不同的稀釋劑批次、基質(zhì)批次或分析人員）之間的相關(guān)性 。QC趨勢分析中的控制圖的主要類型包括QC的運(yùn)行趨勢圖（run charts），Xbar-R圖，組平均值的單個(gè)控制圖（平均值的運(yùn)行趨勢圖）。運(yùn)行圖表是繪制每個(gè)趨勢測量的最簡單的圖。運(yùn)行圖表通常與顯示一種測量值與另一種測量值之間差異的移動幅度圖結(jié)合。Levey-Jennings(17)是LBA最常用的運(yùn)行圖表(圖1)。另一種常見的控制圖是Xbar-R圖。這種圖表類型演示了每組數(shù)據(jù)的平均值及其范圍的趨勢。圖1. Levey-Jennings圖示例。水平紅線為下/上限值（lower/upper control limits，L/UCL）；虛線水平橫線為觀測平均值（μ0）。這些圖表的控制限制是基于檢測內(nèi)的可變性建立的，這使得它們不太適合LBA QC趨勢分析。圖2是Xbar-R圖的一個(gè)例子。此圖還演示了這些圖表類型是如何導(dǎo)致錯(cuò)誤警報(bào)的。替代Xbar-R圖表的是個(gè)體值控制圖, 標(biāo)繪的值是每個(gè)試驗(yàn)的平均值，這些是平均值運(yùn)行圖表。與Xbar-R圖相比，平均值運(yùn)行圖的平均控制限度是基于試驗(yàn)間的變異性計(jì)算的。對于添加一個(gè)Xbar-R圖表到平均值運(yùn)行圖上用于監(jiān)控分析內(nèi)變化趨勢仍然是有用的。圖2. Xbar-R圖的示例。Xbar圖表顯示了每個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值；底部是R圖，表示每個(gè)分析的觀察范圍。對于這兩張圖，水平的紅線是下限值和上限值; 水平黑線虛線是實(shí)驗(yàn)中觀察到的平均值。限于篇幅，相關(guān)圖表就介紹到此，對所有細(xì)節(jié)感興趣者請參閱文末的參考文獻(xiàn)。防止分析漂移LBA的性能取決于其生物試劑組成的性能。這類分析方法嚴(yán)重依賴于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用和分析試劑的結(jié)合特性，所有這些都影響分析組分對目標(biāo)待測物的反應(yīng)活性。隨著時(shí)間的推移，這些因素使LBA容易發(fā)生校準(zhǔn)偏移（calibration drift）。例如，蛋白質(zhì)脫酰胺化或僅由一個(gè)糖基改變的糖基化模式就可能導(dǎo)致偏移。校準(zhǔn)偏移的早期跡象包括但不限于校準(zhǔn)曲線的斜率和漸近線的變化，分析中定量上限和下限的偏移，所有這些都可能導(dǎo)致樣本濃度計(jì)算過低或過高。最終，校準(zhǔn)偏移導(dǎo)致對藥物動力學(xué)的錯(cuò)誤描述。作為補(bǔ)充材料的一部分，提供了LBA校準(zhǔn)偏移的常見原因列表。以下部分提供了預(yù)防方法偏移的評估和緩解策略。不管出于何種根本原因，以下參數(shù)均有助于識別效能偏移（performance drift）:標(biāo)準(zhǔn)曲線& 監(jiān)測校準(zhǔn)點(diǎn)濃度-響應(yīng)關(guān)系，以確保校準(zhǔn)曲線的響應(yīng)值，特別是零和高濃度點(diǎn)的響應(yīng)值，與研究前驗(yàn)證期間觀察到的響應(yīng)值相比，沒有變化。這確保了LLOQ和ULOQ基本完整，其變異性（variability）與驗(yàn)證中所觀察到的一致。& 確保校準(zhǔn)曲線的斜率和漸近線與方法驗(yàn)證期間觀察到的變異性一致。& 選擇適當(dāng)?shù)奶鎿Q校準(zhǔn)品原液/參照品（reference standards），其效能特征與現(xiàn)有的校準(zhǔn)品最相似。& 確保滿足先前建立的等價(jià)條件（equivalence criteria）。& 關(guān)于校準(zhǔn)曲線性能的其它建議，可以參考本文末DeSilva/Viswanathan/Azadeh等人的文章。質(zhì)量控制樣品& 根據(jù)之前建立的程序，交叉評估現(xiàn)有的和替換的QCs和/或校準(zhǔn)曲線。加入陰性對照品和覆蓋了測試范圍的陽性對照品。& 追蹤合格的QCs遺留批次和替換批次的測量值之間的百分比（%）差異。& 長期監(jiān)控應(yīng)包括上述遺留批次的百分比（%）差異的趨勢 (或標(biāo)稱值，如果沒有遺留批次)。& 建議包括稀釋的QC。& 確保滿足先前建立的等價(jià)條件（equivalence criteria）。金標(biāo)準(zhǔn)樣品（gold standard samples，Proficiency Panel）金標(biāo)準(zhǔn)樣品，例如美國藥典（USP）或世衛(wèi)組織標(biāo)準(zhǔn)（WHO）的標(biāo)準(zhǔn)品，可能只適用于臨床實(shí)驗(yàn)室的檢測，但如果可以獲得時(shí)，可用于：& 同時(shí)評估金標(biāo)準(zhǔn)樣本和QC樣品，有助于識別校準(zhǔn)曲線的漂移以及替換QCs的質(zhì)量認(rèn)證。& 如果金標(biāo)準(zhǔn)樣品不存在,可以保留一組具有足夠穩(wěn)定性的研究樣本，在未來替代QCs樣品的質(zhì)量認(rèn)證中作為金標(biāo)準(zhǔn)。雖然控制圖（control charts）是有效的監(jiān)測工具，但它們僅利用從各自的校準(zhǔn)曲線得出的QC樣品的檢測濃度。這意味著校準(zhǔn)曲線和QC批次都是由相同的試劑制備的。交叉評估現(xiàn)有和替代QCs是正確的趨勢分析和防止漂移的關(guān)鍵方法。在這方面，保留遺留的QC批次，并將它們與新QC批次橋接起來就顯得頗為重要。因此，趨勢研究和漂移監(jiān)測最有效的方法就是交叉評估，即根據(jù)現(xiàn)有和替換的校準(zhǔn)曲線來評估任何給定的QCs的效能。在保持可靠的趨勢和檢測漂移上，關(guān)鍵是下列問題：1. 一個(gè)適當(dāng)?shù)摹⒑细竦幕旌匣|(zhì)：經(jīng)過驗(yàn)證的分析方法應(yīng)明確認(rèn)證替換混合基質(zhì)的測試設(shè)計(jì)和接受標(biāo)準(zhǔn)。2. 適當(dāng)?shù)倪\(yùn)行次數(shù)：有助于最大限度地降低可變性。3. 每次運(yùn)行使用足夠/適當(dāng)數(shù)量的QC：大多數(shù)機(jī)構(gòu)指南以及大量文獻(xiàn)都提出了相關(guān)建議。4. 適當(dāng)?shù)奈恢每勺冃裕簩C樣品置于微孔板的左上和右下四分位點(diǎn)，或適當(dāng)?shù)胤胖迷谶\(yùn)行開始和結(jié)束的時(shí)候 (使用Lever-Jennings原則來監(jiān)測QC的效能)。5. 在方法開發(fā)的早期和預(yù)研究驗(yàn)證中引入變化性的條件：不同的分析人員、不同時(shí)間段、多個(gè)微小規(guī)模的制備工作都是為了捕獲變化因素。討論成功地管理LBA方法的生命周期是通過證明質(zhì)量控制樣品（QCs）效能的一致性而實(shí)現(xiàn)的。由于QCs是關(guān)鍵的監(jiān)控工具，所以實(shí)驗(yàn)室必須建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)程序（SOPs），以制備、認(rèn)證QCs并監(jiān)測其效能趨勢。本文旨在提供：1.與LBA的QCs相關(guān)的指南和最佳做法，同時(shí)在生物分析界建立共識；2.提出了更換QC批次的認(rèn)證方法，并提供了監(jiān)測QC效能的實(shí)用方法；3.討論了管理和應(yīng)對QCs樣品的各種問題，可以作為生物分析實(shí)驗(yàn)室的參考文獻(xiàn)。特別聲明本文如有疏漏和誤讀相關(guān)指南和數(shù)據(jù)的地方，請讀者評論和指正。所有引用的原始信息和資料均來自已經(jīng)發(fā)表學(xué)術(shù)期刊、官方網(wǎng)絡(luò)報(bào)道等公開渠道, 不涉及任何保密信息。參考文獻(xiàn)的選擇考慮到多樣化但也不可能完備。歡迎讀者提供有價(jià)值的文獻(xiàn)及其評估。擴(kuò)展閱讀參 考 文 獻(xiàn)1. 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